杨 静 陈 娜 崔晓雪

天津渤海职业技术学院环境与化工学院 天津 300042

黄芩是我国传统中药材之一，其次生代谢产物含量黄芩苷等具有清热燥湿、消炎、抗病毒和抗菌等多种病理效用[1]。利用悬浮培养技术可以获得高质量、高产量的黄芩替代品，具有次生代谢产物含量高、抗氧化活性较强的优点。近年来，国内对于植物细胞悬浮培养研究有较多报道。黄燕芬[2]等研究了碳氮磷营养对百蕊草悬浮培养细胞生长的影响。曲丹[3]考察了碳源对迷迭香悬浮培养细胞的生长、迷迭香酸积累及抗氧化酶活性的影响。本文通过考察黄芩细胞悬浮培养过程的碳源、氮源和磷源对黄芩细胞生长和黄芩苷产物合成的影响，为大规模利用黄芩悬浮培养细胞技术生产黄芩苷提供基础数据和理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

黄芩种子购自河北省安国市药材市场，黄芩苷对照品购自中国药品生物制品检定所；化学试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器

TCYA ZYSA0351型摇床，202型电热恒温干燥箱，BCN-1360型超净工作台，Satorius BS 2202S型电子天平，UV-7500紫外分光光度计，HPG-280B强光照培养箱等。

1.3 方法

1.3.1 黄芩无菌苗的获得

取饱满的黄芩种子用75%的乙醇浸泡1min，用无菌水冲洗3次，在2%的次氯酸钠溶液中进行表面消毒20min，再用无菌水冲洗5次。

将消毒灭菌的种子接种于添加0.2mg/L6-BA的MS培养基上，pH5.8，光照16h培养，4～5d种子萌发，20d后可得长势良好的试管苗。

1.3.2 黄芩愈伤组织的诱导

取黄芩试管苗幼嫩茎段，用自来水冲洗干净，75%的乙醇消毒30s，无菌水冲洗3次，切成0.5cm左右长的小段，接种于愈伤组织诱导培养基上培养。培养条件为MS培养基，附加有1.0mg/L6-BA、2.0mg/LNAA、3%蔗糖、1%琼脂，pH5.8，培养条件为25±1℃，暗培养。培养大约6周后可得愈伤组织。

1.3.3 黄芩愈伤组织的增殖

挑选生长良好疏松的愈伤组织称重后进行继代培养，其培养条件同诱导培养基。继代培养3次后获得生长稳定、质地疏松的黄芩愈伤组织。

1.3.4 不同碳源种类对黄芩细胞悬浮培养的影响

将愈伤组织2g接种到250mL三角瓶中培养，三角瓶内含50mL液体培养基(MS+1.5mg/L6-BA+0.5mg/LNAA)，培养基中分别添加3%蔗糖、3%果糖、3%葡萄糖、1.5%蔗糖+1.5%果糖，1.5%蔗糖+1.5%葡萄糖，1.5%果糖+1.5%葡萄糖。培养基pH5.8，摇床转速120r/min，每组重复3～4瓶。

1.3.5 不同蔗糖质量浓度对黄芩细胞悬浮培养的影响

愈伤组织接种到1.3.4所述培养基中，培养基中添加2%、3%、4%、5%、6%的蔗糖。培养基的pH和摇床转速如上，每组重复3～4瓶。培养20天后，分别测定培养过程中黄芩细胞悬浮系的生长环境、生物量及黄芩苷含量，重复试验3次。

1.3.6 氮源对黄芩细胞培养的影响

愈伤组织接种到1.3.4所述培养基中，培养基中添加3%的蔗糖，原MS培养基中的NH4NO3用(NH4)2SO4代替，即KNO3提供硝态氮和(NH4)2SO4和铵态氮。设计MS培养基中其他基本成分及激素配比不变，固定氮源总量为60mmol·L-1改变，铵态氮与硝态氮的比例分别为0∶60、10∶50、20∶40、30∶30、40∶20、50∶10和60∶0。培养基的pH和摇床转速如上，每组重复3～4瓶。

1.3.7 磷源对黄芩细胞培养的影响

愈伤组织接种到1.3.4所述培养基中，培养基中添加3%的蔗糖，同时向培养基中添加基本MS培养基1/2、1倍、2倍、4倍、8倍的KH2PO4。培养基的pH和摇床转速如上，每组重复3～4瓶。

1.3.8 生物量的测定

取悬浮细胞液置于离心管中，转速8000r/min，离心15min，弃去上清液，用蒸馏水洗涤细胞2～3次，弃去上清液，称得到沉淀细胞质量，即为细胞鲜重，置于烘箱中60℃干燥7～8h以至恒重，称其质量为细胞干重。干重增殖倍数=(收获时细胞干重-接种时细胞干重)/接种时细胞干重。

1.3.9 黄芩苷含量测定

1.3.9.1 样品溶液的制备

黄芩苷的提取在参照张进杰等[4]的方法，做出改进，将黄芪细胞培养物50℃下烘干至恒重，置于研钵内，研磨成粉末，取黄芩干细胞粉用95%乙醇超声20min提取两次，每次干细胞∶乙醇为1∶100(W∶V)；将两次混合提取液减压浓缩至浸膏状，用95%乙醇溶解定容至50mL备用。

1.3.9.2 黄芩苷含量测定

将制备好的溶液用紫外可见分光光度计在最大吸收波长278nm处测定吸光度A，根据标准曲线计算培养液中的黄芩苷含量。另取95%的分析乙醇作空白。

1.3.9.3 标准工作曲线的绘制

精密称取0.0100g黄芩标准品，配制成100μg/mL黄芩苷标准品的乙醇溶液，用移液管分别移取0.5、1、1.5、2、2.5mL于5个10mL的容量瓶中，用95%的分析乙醇定容至刻度，充分摇匀，放置10min。以空白乙醇溶液为参比，在278nm处用紫外分光光度计测定其吸光度。以吸光度A为纵坐标、黄芩苷含量C(ug/mL)为横坐标绘制标准工作曲线，曲线方程为A=0.5117C+0.0576，相关系数R2=0.9997。

图1 黄芩苷标准曲线

2 结果与分析

2.1 不同种类碳源对黄芩细胞悬浮培养的影响

从表1中可以看出3%蔗糖为碳源时明显有利于黄芩细胞的增殖，而以3%果糖为碳源时黄芩细胞合成的黄芩苷的含量达到了最高。综合考虑细胞生长和经济成本，选用蔗糖作为碳源。

表1 不同碳源对黄芩细胞悬浮培养的影响

2.2 不同蔗糖浓度对黄芩细胞悬浮培养的影响

2.2.1 不同蔗糖浓度对黄芩细胞生长的影响

图2 不同蔗糖浓度对黄芩细胞悬浮培养影响

如图2所示，不同浓度蔗糖的培养条件下，随培养时间增长，细胞干重逐渐增加，到20天的时候达到最大值，然后开始下降。添加3%蔗糖的培养基中细胞干重增长率最高，达到5.49。蔗糖浓度4%和5%相比，蔗糖浓度5%的黄芩细胞悬浮培养体系的生物量积累更稳定且在第20天时达到峰值。当添加蔗糖为6%时，培养20天时细胞干重增加较明显，之后细胞干重下降不明显，原因是培养基中仍有未消耗殆尽蔗糖。综合分析，黄芩细胞培养最适合的蔗糖添加量是3%，当培养20天时可以得到最大干重产量。

2.2.2不同蔗糖浓度对黄芪苷合成的影响

图3 不同蔗糖浓度对黄芩苷合成的影响

图3为培养过程中黄芩苷合成的动力学曲线，结合图2可以看出在培养周期内随着黄芩细胞干重增加黄芩苷的合成也在逐渐增加，即黄芩细胞生长和次生代谢产物的合成存在一定的相关性。在20天的生长周期中，五个浓度的蔗糖细胞悬浮培养体系的黄芩苷合成趋势是先缓慢稳定增加，然后迅速生长，直到生长周期的最后一天达到最高。在培养20天时，蔗糖浓度为3%的黄芩细胞悬浮体系的黄芩苷含量达到最高。

2.3 氮源对黄芩细胞培养的影响

表2 氮源对黄芩细胞悬浮培养的影响

由表2可见不同的NH4+/NO3-对细胞生长量和黄芩苷成分含量均具有显著的影响。较高比例的硝态氮有利于细胞生长量的积累，培养基里全部是硝态氮时，细胞鲜质量和干质量达到最大值，但此时黄芩苷含量相对较低。继续增大NH4+/NO3-的比值，黄芩细胞鲜重和干重均在下降，当培养液中全部是NH4+时，黄芩细胞几乎停止生长，而高浓度的硝态氮则更有利于黄芩类成分积累。当铵态氮为唯一氮源时细胞内黄芩苷含量达到最大值47.29μg/g。考虑细胞的生长和黄芩苷的合成，当NH4+/NO3-为30∶30时，细胞生长较好，黄芩苷含量较高。

2.4 磷源对黄芩细胞培养的影响

表3 磷源对黄芩细胞悬浮培养的影响

从表3中可以看到，KH2PO4的浓度的变化会影响黄芩细胞生长和黄芩苷的合成。当KH2PO4浓度增加到基本培养基1/2时，黄芩苷的合成量达到了最高。当KH2PO4浓度继续升高时，黄芩苷的含量开始下降，可见高浓的KH2PO4会抑制黄芩苷的合成实验表明，向培养基中添加基本MS培养基1/2倍的KH2PO4时，黄芩细胞生长量和黄芩苷合成达到最大。

3 结论

植物组织培养过程中一般是添加蔗糖、葡萄糖或果糖，其中以蔗糖最常用。岳建华等[5]采用蔗糖、葡萄糖和麦芽糖等碳源对早花百子莲愈伤组织进行诱导，愈伤组织诱导率分别为86.00%、72.00%和59.67%。在研究秦艽细胞悬浮培养时发现，30g/L的蔗糖浓度有利于秦艽悬浮细胞的生长及龙胆苦苷积累[6]。可见，对于不同的植物，适合其生长和次生代谢产物积累的碳源种类和浓度也有较大差异。蔗糖除了为细胞悬浮系提供能量之外，还能够诱导愈伤组织进行再分化，在植物细胞悬浮培养基中还具有渗透调节剂的作用。

氮植物细胞生长、发育及次生代谢物产生必不可少的营养物质，对悬浮细胞生长具有重要影响。研究发现，硝态氮和铵态氮比例为5∶1时，甘草细胞获最大生物量，以铵态氮为氮源，黄酮类物质积累量最高[7]。高比例下的硝态氮有利于细胞生物量积累，高比例下铵态氮则有利于黄芩苷的合成，而过量铵态氮对细胞生长有抑制作用。这可能是培养基中较低浓度的铵盐进入细胞会被及时代谢掉，铵态氮过量时会蓄积伤害细胞，从而影响细胞的生长。

磷是植物体内的核酸、核蛋白、磷脂和多种酶的组成成分，对次生代谢物的生物合成也有非常重要的作用。在太子参不定根培养中，低磷酸盐浓度有利于生物量的产生，而高磷酸盐浓度则能显著提高太子参不定根培养中多糖的含量[8]。