孙彦蒙， 王梦园， 李 政， 王世富， 周卫萍， 李仁哲， 陈艳萍， 刘志伟， 孙淑红，李艳华， 李宜雷， 李 艳， 满思金0， 李 静， 寇琳娜， 于文文， 张春艳

流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）是一种只侵犯人类的革兰阴性杆菌，可引起成人和儿童社区获得性肺炎、鼻窦炎和化脓性中耳炎等[1-2]，成人感染主要以下呼吸道为主，也可见菌血症等全身症状，老年人则以流感后继发感染居多（如气管炎、肺炎等）；流感嗜血杆菌作为儿童时期细菌性脑膜炎、肺炎和菌血症的主要细菌性病原体，还可导致化脓性关节炎和眼内炎等[3-4]。在世界范围内，β型流感嗜血杆菌感染每年导致近40万儿童死亡，其中95%以上的死亡发生在发展中国家，15%～35%的β型流感嗜血杆菌脑膜炎患儿可有智力低下、听力丧失等严重后遗症[5]。本研究对山东省50所医院临床分离流感嗜血杆菌进行了耐药性监测，旨在了解流感嗜血杆菌感染随年龄和季节变化的特点，监测其对常用针对性抗菌药物的敏感率和耐药率，为临床有效诊治提供数据支持，同时指导临床医师对药物的合理应用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 本研究依托于山东省儿童细菌&真菌耐药监测研究协作网（SPARSS网），SPARSS网由山东省50所成员单位构成，其中三级医院44所、二级医院6所，涵盖了山东省16个地市，监测数据具有区域代表性。收集2017年1月1日—2019年12月31日上述医院分离的流感嗜血杆菌，剔除同一患者的重复菌株，共获得18 057株。

1.1.2 实验材料 流感嗜血杆菌菌株分离、鉴定和药敏试验，由各成员单位按照各实验室质量控制标准进行严格的质量控制，头孢硝噻吩试剂购自重庆庞通等公司，药敏纸片氨苄西林（10 μg）、氨苄西林-舒巴坦（10-10 μg）、头孢呋辛（30 μg）、头孢他啶（30 μg）、美罗培南（10 μg）、亚胺培南（10 μg）、左氧氟沙星（5 μg）、阿奇霉素（15 μg）、甲氧苄啶-磺胺甲唑（25 μg）、氯霉素（30 μg）购自OXOID等公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株分离、培养与鉴定 样本合格判定标准：痰液，低倍镜下观察每视野鳞状上皮细胞＜10个；气管灌洗液，镜检鳞状上皮细胞1%总细胞数；所有样本留取后均在2 h以内送检，及时接种于流感嗜血杆菌选择性培养基，5%的CO2孵箱中35℃培养18～24 h。自培养基挑取无色、透明、表面光滑、边缘整齐、似露滴状、湿润可疑菌落，由Bruker质谱或细菌鉴定仪进行菌株鉴定。

1.2.2 药敏试验 采用纸片扩散法（K-B）进行流感嗜血杆菌10种药物敏感性试验，结果判读依照CLSI 2021版M100抗微生物药物敏感性试验执行标准进行。以头孢硝噻吩纸片检测β内酰胺酶，10 min内变红为阳性。质控菌株为流感嗜血杆菌ATCC 49247和 ATCC 49766。

1.2.3 统计学分析 采用WHONET 5.6和SPSS l5.0软件进行数据处理和统计分析。

2 结果

2.1 菌株的来源与分布

2.1.1 样本来源分布 2017—2019年SPARSS网分别分离到4 056株、6 211株和7 790株流感嗜血杆菌，共计18 057株纳入统计分析，分离自儿童（＜18岁）和成人（≥18岁）的菌株分别为12 344株和5 713株，占比分别为68.4%和31.6%，分离自6岁以下儿童占总菌数的65.2%。菌株样本分布：呼吸道样本占96.1%（17 351/18 057），其中痰液标本16 523株，咽拭子543株，肺泡灌洗液285株；非呼吸道标本占3.9%（706/18 057），其中外阴分泌物占25.4%（179/706），此外耳分泌物111株、血液53株、脓液39株、脑脊液（CSF）9株、其他样本315株。同时将患者分为学龄前儿童（0～6岁）、学龄期儿童（＞6～12岁）、青少年（＞12～＜18岁）和成年人（≥18岁）4个年龄段人群，并以此对临床分离菌的样本构成进行了分析，见表1。2017—2019年每年分离于痰样本的流感嗜血杆菌分别占当年分离的流感嗜血杆菌总数的88.8%、91.5%、92.9%，呈增长趋势；分离于咽拭子为5.2%、3.7%、1.3%，呈逐年降低趋势；分离于肺泡灌洗液为1.7%、1.7%、1.4%；分离于外阴分泌物为1.2%、0.9%、1.0%；分离于血液为0.2%、0.4%、0.3%。

表1 2017—2019年不同年龄段临床分离流感嗜血杆菌的标本构成Table 1 The sample source of H. influenzae strains in terms of age group from 2017 to 2019 （%）

2.1.2 儿童患者的年龄分布 2017—2019年临床分离流感嗜血杆菌的儿童年龄以＞6月龄～3岁居多，其次是＞1～6月龄，再次为＞3～6岁（图1）。婴幼儿期（＞1月龄～3岁）为流感嗜血杆菌感染的高发阶段，学龄前期儿童（＞3～6岁）亦是不可忽视的流感嗜血杆菌感染的高发人群。

图1 2017—2019年儿童12 344株临床分离流感嗜血杆菌的年龄分布Figure 1 Age distribution of 12 344 strains of H. influenzae isolated from children from 2017 to 2019

2.1.3 流感嗜血杆菌分离的月份分布 每年的2、4、5和12月份流感嗜血杆菌的分离率较高，7～10月份分离率较低（图2）。流感嗜血杆菌感染具有一定的季节性，冬春季高发而夏秋季感染较少。

图2 2017—2019 18 057株儿童和成人临床分离流感嗜血杆菌的季节性分布Figure 2 Seasonal distribution of 18 057 strains of H. influenzae isolated from children and adults from 2017 to 2019

2.2 β内酰胺酶检测

根据β内酰胺酶的检测结果，2017—2019年产β内酰胺酶的流感嗜血杆菌占比分别为63.0%、72.1%、76.6%，呈逐年上升趋势；β内酰胺酶阴性氨苄西林耐药的流感嗜血杆菌（BLNAR）的三年检出率分别为9.7%（241/2 473）、7.9%（237/3 000）和7.3%（328/4 518），均值为8.1%（806/9 991）。见表 2。

表2 2017—2019年18 057株临床分离流感嗜血杆菌的β内酰胺酶检测阳性率及变迁Table 2 Changing prevalence of β-lactamase-producing strains in 18 057 clinical isolates of H. influenzae from 2017 to 2019

2.3 药敏试验

这三年，山东地区分离的流感嗜血杆菌对氨苄西林、氨苄西林-舒巴坦、头孢呋辛耐药率均呈逐年上升趋势；对头孢他啶保持较高的敏感率，三年分别是95.6%、93.4%和95.3%，均值为94.8%；对美罗培南、左氧氟沙星、氯霉素的耐药率有所下降。见表3。

表3 2017—2019流感嗜血杆菌对抗菌药物的耐药率和敏感率Table 3 Susceptibility of H. influenza isolates to antimicrobial agents from 2017 to 2019 （%）

2.4 儿童分离株药敏试验

儿童患者分离的流感嗜血杆菌对氨苄西林、氨苄西林-舒巴坦、头孢呋辛、阿奇霉素、甲氧苄啶-磺胺甲唑的耐药率明显高于新生儿和成人的分离株。见表4。

表4 2017—2019年儿童患者流感嗜血杆菌对抗菌药物的耐药率和敏感率Table 4 Susceptibility of the H. influenza strains isolated from children to various antimicrobial agents from 2017 to 2019 （%）

表4（续）Table 4（continued）

3 讨论

流感嗜血杆菌是人体鼻咽部的共生菌，可黏附并定植于呼吸道上皮细胞且具有迁移到宿主其他生态位的能力[5]。据北京儿童医院临床研究报道，急性下呼吸道感染儿童患者2000—2002年及2010—2012年的流感嗜血杆菌携带率分别为26.1%和16.3%[6]，而高携带率是易发生该菌感染的前提。与之一致，本研究分离的流感嗜血杆菌，主要来自人体呼吸道样本，且该菌感染多见于6岁以下的儿童，这与该年龄段幼儿免疫系统尚未发育完全，对携带的流感嗜血杆菌抵抗力弱，较易在呼吸道病毒感染后继发流感嗜血杆菌感染有关。本文监测数据结果显示，山东省流感嗜血杆菌的感染以冬春季高发、夏秋季低发，这与大多数报道一致[7-8]，可能与北方地区冬春季节交替、天气寒冷，人体易感风寒致使呼吸道感染疾病整体高发有关。

本研究呼吸道样本以痰液居多，其次为咽拭子、肺泡灌洗液样本，其中儿童肺泡灌洗液的样本占比低于成人。除呼吸道样本之外，外阴分泌物（占25.4%）是非呼吸道样本的主要类型，且儿童患者样本占比高于成人。儿童外阴炎最常见的病原体为化脓链球菌和流感嗜血杆菌，真菌和病毒少见[9]，而化脓链球菌引发的外阴感染常伴口咽炎及皮疹等症状，未伴有其他部位症状的儿童外阴炎则多由流感嗜血杆菌引起。我国珠三角地区和聊城地区由流感嗜血杆菌所致的小儿细菌性外阴炎占比分别为24.9%和31.49%[10-11]，鉴于儿童与成人阴道炎病原体构成的迥异，流感嗜血杆菌所致的儿童外阴炎病的精准诊断和抗生素合理应用值得临床医师重视。

早年文献报道流感嗜血杆菌对氨苄西林耐药的主要机制是由质粒携带tem和rob基因编码的TEM及ROB型β内酰胺酶，并以TEM型为主[12-13]。自2000年至2012年，由于产β内酰胺酶的流感嗜血杆菌检出率逐年增加，我国儿童分离的流感嗜血杆菌对氨苄西林的敏感率由96%下降至61%[6]，且近年来耐药率呈逐年持续上升趋势。据2017—2019年的CHINET耐药监测网报告，流感嗜血杆菌对氨苄西林的耐药率呈现逐年增加的趋势；且儿童和成人的耐药率差异显著，其中2019年的数据显示儿童的耐药率（70.2%）明显高于成人（59.7%）[14-16]。本组资料显示山东省儿童流感嗜血杆菌对氨苄西林的耐药率亦远高于成人，儿童和成人菌株对氨苄西林的耐药率均呈逐年递增趋势，且耐药率远高于全国平均水平[7-8,12-14,17]。此外，近年来关于由ftsI基因编码的转肽酶导致青霉素结合蛋白PBP3的构象变化从而导致其与β内酰胺类抗生素亲和力降低的报道日渐见多[18]。这种非产酶机制所致的氨苄西林耐药菌被称之为BLNAR。本组资料同样显示具有BLNAR现象的菌株三年间的平均检出率为8.1%，与ISPED通过对13 810株流感嗜血杆菌监测报告的8.22% BLNAR检出率相近[19]，但近年来日本流行（＞40%）的β内酰胺酶阴性的高水平氨苄西林耐药流感嗜血杆菌（high-BLNAR）[20]，是否有向国内播散的趋势，值得进一步监测。

本组监测资料显示山东省临床分离流感嗜血杆菌的一个重要特征是耐药率显著高于同期全国及其他地区的报道。如本组流感嗜血杆菌对氨苄西林、头孢呋辛、甲氧苄啶-磺胺甲唑的耐药率及对阿奇霉素的不敏感率逐年上升，同期儿童分离株的耐药率显著高于成人株，这与CHINET报道的结果一致[14-16]。CHINET报道的2017—2019年流感嗜血杆菌对氨苄西林的耐药率和阿奇霉素的非敏感率亦呈现出逐年增加的趋势，且其中儿童菌株对氨苄西林的耐药率亦高于成人菌株的耐药率。山东地区流感嗜血杆菌对上述4种抗菌药物的耐药率均显著高于全国同期水平，且儿童流感嗜血杆菌的耐药率远高于成人[14-16]。推测可能是由于儿童较成人易发生呼吸道感染，本地区使用上述4种抗菌药物进行经验治疗的频率较高，使定植于上呼吸道的流感嗜血杆菌在抗菌药物的选择压力下，不断被选择筛选出耐药菌株，因此亟需加强抗菌药物在医疗机构的合理使用。

本组资料显示，第三代头孢菌素（头孢曲松、头孢噻肟、头孢他啶）对流感嗜血杆菌一直保持着较高的抗菌活性，细菌对其一直保持着较高的敏感性。此外，流感嗜血杆菌对美罗培南、左氧氟沙星、氯霉素的耐药率也均在10%以下，且在2017—2019年无显著变化趋势。许多仅涉及单一医院或地区的报道显示流感嗜血杆菌对美罗培南和头孢曲松全敏感[7-8]，而全国性的综合报道显示流感嗜血杆菌对美罗培南和头孢曲松不敏感率分别为2%和8%[16]，这种差异表明不同地区间流感嗜血杆菌的耐药性存在着较大差异，中国东部和西部儿童医院美罗培南的非敏感率分别为0.13%和1.89%[19]。尽管流感嗜血杆菌对左氧氟沙星和氯霉素显示较高的敏感性，但由于儿童对其的不良反应较大，因此在用于儿童流感嗜血杆菌感染的治疗时需谨慎。此外，碳青霉烯类药物同样不推荐作为治疗的首选药物，以避免诱导菌株产生耐药性，除非有危及生命的侵袭性流感嗜血杆菌感染或头孢菌素类药物治疗失败的患者[21]。2019年的《儿童流感嗜血杆菌感染诊断及治疗专家建议》中指出，发生流感嗜血杆菌的一般感染时宜选用第三代头孢菌素[22]。本组资料显示的流感嗜血杆菌对抗菌药物的耐药率和非敏感率与2019年的《儿童流感嗜血杆菌感染诊断及治疗专家建议》一致[22]。

综上所述，目前山东省流感嗜血杆菌的耐药形势比全国更加严峻，尤其是在儿童流感嗜血杆菌感染患者中，产β内酰胺酶的菌株检出率极高，氨苄西林已不能作为临床一线用药，因此，十分必要对流感嗜血杆菌的耐药性进行持续监测和宣讲，从而指导临床合理使用抗菌药物，以减缓耐药流感嗜血杆菌的快速增长。

致谢：感谢50所山东省微生物组学研究中心儿童细菌&真菌耐药监测研究协作网成员单位为本文提供的数据支持。