陈 豪 兰 剑 聂春桃 陈 环 李 翌 瞿明仁 宋小珍

(江西农业大学，江西省动物营养重点实验室/营养饲料开发工程研究中心，南昌 330045)

南方夏季高温高湿环境极易诱发肉牛热应激，导致其食欲下降、免疫力低下、养分利用率降低，甚至出现热射病，严重影响肉牛的生产性能和养殖效益[1]。为缓解热应激对肉牛生产的不利影响，很多热应激防治方法被大量研究。如采取遮荫、喷淋、加装风扇等措施来降低牛舍的温度；通过提高饲粮蛋白质水平、增加饲喂次数来提高肉牛养分摄入量；或是在肉牛出现热应激疾病时使用抗生素类药物治疗，这些都在一定程度上缓解了肉牛热应激反应，但也大大增加了饲养成本，甚至可能带来肉品安全和生态环境破坏等问题。因此，寻找到一种安全、经济、有效的抗热应激添加剂应用于肉牛生产就显得尤为重要。锦江黄牛是江西著名的地方肉牛品种，经过长期选育繁殖，具有抗高温高湿、耐粗饲、抗病力和遗传稳定性强等优点，而且肉质鲜美、营养均衡、食用口感好[2]。

植物提取物通常指通过水提法、醇提法或超临界流体萃取等手段从植物中提取的活性成分，包括生物碱类、黄酮类、多糖类等[3]。植物提取物源自天然，具有无毒副、无残留、功能多样等特性，因而近年来在热应激防治上被大量研究。葛根素(puerarin)是从药食同源植物葛根中提取的异黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗应激等多种作用[4]。汪纪仓等[5]研究发现，当饲粮中添加0.8 g/kg的葛根素时，其具有改善肉品质的作用，并且可提高肉鸡抗氧化能力。Peng等[6]报道，饲粮中补充葛根素可增强免疫，缓解肉牛热应激，调节脂肪代谢。橙皮苷(hesperidin)是传统中药陈皮的主要活性成分之一，具有双氢黄酮氧苷结构，属于二氢黄酮衍生物，大量研究表明其具有抗氧化、抗炎、健脾促消化等功效[7-8]。赖星等[9]研究发现，橙皮苷可中和活性氧(ROS)并显著提高血浆中过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性，缓解仔猪的氧化应激，维护肠道微生物区系平衡，提高仔猪的抗氧化及免疫功能进而促进其生长。杨季[10]研究发现，在饲粮中添加50～100 mg/kg橙皮苷可以明显提高肉仔鸡的平均日增重，降低料重比(F/G)和腿肌的剪切力，增强血清和组织抗氧化及免疫功能，促进肠道形态发育。这表明葛根素、橙皮苷作为添加剂使用有缓解动物热应激、提高机体免疫功能等作用；但目前有关葛根素、橙皮苷对热应激条件下肉牛养分表观消化利用及其机理的影响鲜有报道。因此，本试验在前期研究基础上，探讨饲粮中添加葛根素、橙皮苷及其复合物对热应激条件下锦江黄牛养分表观消化率和粪便菌群组成的影响，旨在为葛根素、橙皮苷作为肉牛抗热应激添加剂提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用的葛根素、橙皮苷均购于陕西某公司，纯度分别为98%、90%。

1.2 试验饲粮

基础饲粮参考《肉牛饲养标准》(NY/T 815—2004)配制，精粗比为5∶5，其组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) %

1.3 试验设计

本试验选用4头健康、体况良好、体重在250 kg左右的锦江黄牛。采用4×4拉丁方试验设计，全程共分为4个试验期，每个试验期时长为16 d，每个试验期的后4 d为采样阶段，采样结束后即开始下1期试验。试验分为4个组，对照组饲喂基础饲粮，葛根素组饲喂基础饲粮+0.04%葛根素(饲粮干物质占比，下同)，橙皮苷组饲喂基础饲粮+0.20%橙皮苷，复合组饲喂基础饲粮+0.04%葛根素+0.20%橙皮苷。试验选在夏季高温高湿环境[平均温度31.8 ℃，相对湿度75.4%，温湿指数(THI)84.6]下进行。

1.4 饲养管理

单栏圈养，每天饲喂2次(08：00和18：00)，先精后粗，精粗比为5∶5，自由饮水。每日记录精粗料采食量。其他管理办法同牛场。

1.5 样品采集

1.5.1 饲料样品采集

试验每期采集少许精料和粗饲料样品，混合均匀后按四分法取样，65 ℃烘箱烘干48 h，再回潮24 h，随后进行粉碎，再分装入自封袋中冷冻保存。

1.5.2 粪样采集

采取全收粪法，每期试验的第13～15天，连续3 d收集试验牛的全部粪便，混匀、称重。每天取每头牛鲜粪总重的5%，混合，按100 g加20 mL 10%的硫酸固氮，-20 ℃保存。

1.6 检测指标

1.6.1 牛舍环境温度、湿度以及牛的体温、呼吸频率

在每期试验的第1、4、7、10、13、16天记录试验牛的体温(肛温)、呼吸频率等。在牛舍距离地面1.5 m处的位置悬挂2个温湿度计，在每天的07:30、13:00和19:30记录牛舍内的温度和湿度，计算每天牛舍内环境的温湿度指数(THI)，计算公式如下：

THI=td-(0.55-0.55×RH)×(td-58)。

式中：td为华氏温度(℉)，td=摄氏温度(℃)×1.8+32；RH为相对湿度(%)。

1.6.2 养分表观消化率

饲粮及粪便中干物质(DM)、粗蛋白质(CP)、粗脂肪(EE)、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)等指标测定方法参照张丽英主编的《饲料分析及饲料质量检测技术》进行。

某养分表观消化率(%)=100×(饲粮中该养分含量-粪便中该养分含量)/饲粮中该养分含量。

1.6.3 菌群多样性测定与分析

利用16S rRNA基因测序技术测定粪便菌群多样性，具体操作由上海美吉生物医药科技有限公司完成。通过MiSeq PE300测序平台进行微生物多样性检测，分析在门水平和属水平的群落物种组成及相对丰度。以提取的样品总DNA为模板，对细菌16S rRNA V3～V4高变区两侧的引物进行PCR扩增，所采用的细菌通用引物序列为338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。

1.7 数据统计与分析

先对试验数据进行录入和初步整理，再根据4×4拉丁方试验设计方案进行后续统计分析，以SPSS 22.0中一般线性模型进行单变量分析，将试验牛只和试验时期作为固定效应，采用Tukey法为主，以LSD法为辅进行两两比较。P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 牛舍环境及THI变化

根据记录的每日牛舍内的温度和湿度，计算牛舍内的THI并绘制成图，如图1所示。从图中可以看到，在试验期间，牛舍内的THI始终处于高位，全部高于72，表明试验牛处于热应激状态，符合试验所需的热应激条件。

图1 牛舍环境温度、相对湿度和温湿度指数Fig.1 Temperature,relative humidity and THI in house of cattle

2.2 葛根素、橙皮苷对热应激条件下锦江黄牛采食量、体温和呼吸频率的影响

由表2可知，与对照组相比，各试验组采食量均无显著变化(P>0.05)，复合组的体温显著下降(P<0.05)，葛根素组、橙皮苷组的呼吸频率显著下降(P<0.05)。

表2 葛根素、橙皮苷对热应激条件下锦江黄牛采食量、体温和呼吸频率的影响Table 2 Effects of puerarin and hesperidin on feed intake,body temperature and respiratory rate of Jinjiang yellow cattle under heat stress

2.3 葛根素、橙皮苷对热应激条件下锦江黄牛养分表观消化率的影响

由表3可知，与对照组相比，葛根素组的干物质、粗蛋白质和中性洗涤纤维表观消化率显著升高(P<0.05),橙皮苷组的粗脂肪表观消化率显著升高(P<0.05),复合组的粗脂肪、中性洗涤纤维表观消化率显著升高(P<0.05)。

表3 葛根素、橙皮苷对热应激条件下锦江黄牛养分表观消化率的影响Table 3 Effects of puerarin and hesperidin on nutrient apparent digestibility of Jinjiang yellow cattle under heat stress %

2.4 葛根素、橙皮苷对热应激条件下锦江黄牛粪便菌群组成的影响

2.4.1 α多样性分析

由表4可知，与对照组相比，葛根素组的Simpson指数显著下降(P<0.05)；橙皮苷组的Shannon、Sobs指数显著升高(P<0.05)，Simpson指数显著下降(P<0.05)。4个组的覆盖度均大于0.99，能准确地反映热应激条件下锦江黄牛粪便菌群的组成。

表4 葛根素和橙皮苷对热应激条件下锦江黄牛粪便菌群丰富度和多样性指数的影响Table 4 Effects of puerarin and hesperidin on fecal microflora richness and diversity indexes of Jinjiang yellow cattle under heat stress

2.4.2 葛根素、橙皮苷对热应激条件下锦江黄牛粪便菌群相对丰度的影响

由表5可知，门水平上，与对照组相比，葛根素组的放线菌门(Actinobacteriota)相对丰度显著升高(P<0.05)，橙皮苷组、复合组的拟杆菌门(Bacteroidetes)相对丰度显著升高(P<0.05)，放线菌门(Actinobacteriota)相对丰度显著升高(P<0.05)。属水平上，与对照组相比，3个试验组的罗姆布茨菌属(Romboutsia)和橙皮苷组的理研菌科RC9肠道菌群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)相对丰度都显著升高(P<0.05)。其他菌种各组间差异不显著(P>0.05)。

表5 葛根素和橙皮苷对热应激条件下锦江黄牛粪便菌群相对丰度的影响 Table 5 Effects of puerarin and hesperidin on relative abundance of fecal microflora of Jinjiang yellow cattle under heat stress %

3 讨 论

3.1 饲粮中添加葛根素和橙皮苷对热应激条件下锦江黄牛体温和呼吸频率的影响

一般情况下，当THI>72时，表示处于热应激状态，7288时为高度热应激[11]。在本试验全期的THI均高于72，其中有64 d的THI>79，表明试验牛在试验期间绝大部分处于中度热应激状态。肉牛属恒温动物，体温和呼吸频率是衡量其生理状况的重要指标。高温高湿条件下，肉牛需要通过增加呼吸频率来提高机体散热能力；而当体内的热量无法通过加快呼吸散失时，可能出现体热平衡被打破，体温升高。本试验中，葛根素组和橙皮苷组的锦江黄牛呼吸频率显著降低，这提示饲粮中添加葛根素和橙皮苷均能缓解锦江黄牛的热应激反应。葛根素由中药葛根提取而得，葛根为豆科植物葛的干燥根，具有清热解毒、生津止渴之功效。徐洋等[12]在夏季肉牛饲粮中添加0.1%的葛根素可降低肉牛的呼吸频率与体温，缓解热应激反应。橙皮苷是一种广泛存在于柑橘属水果中的天然黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、抑菌和抗癌等多种生物活性。

刘海林等[13]用薄荷、陈皮、藿香和石膏组成的中药配方配合益生菌饲喂热应激奶牛，使奶牛奶产量提高，各试验组直肠温度、呼吸频率和心率的全期平均值均低于对照组。此外，本试验结果还显示，葛根素+橙皮苷复合组的体温显著下降，这提示葛根素和橙皮苷在缓解肉牛热应激反应上可能存在一定的互作效应。

3.2 饲粮中添加葛根素和橙皮苷对热应激条件下锦江黄牛养分表观消化率的影响

有报道显示，热应激可能引起机体缺氧缺血，体内大量的血液会被分配到体表帮助散热,从而导致消化道血流量减少，胃肠结构受损，养分消化利用率降低[14]。张灿[15]研究发现，湿热应激状态下藏绵羊和山羊营养物质表观消化率降低。本试验结果显示，与对照组相比，葛根素显著提高了热应激锦江黄牛干物质、粗蛋白质、中性洗涤纤维的表观消化率，橙皮苷显著提高了热应激锦江黄牛粗脂肪的表观消化率，复合添加显著提高了热应激锦江黄牛粗脂肪、中性洗涤纤维的表观消化率。其原因可能与葛根素、橙皮苷中含有的黄酮类物质能增强动物抗氧化能力、增加食欲、缓解热应激有关[16]。李俊年等[17]研究发现，随葛藤草粉替代饲粮中苜蓿草粉水平的增加，波杂山羊的干物质、中性洗涤纤维和粗蛋白质表观消化率均有显著提高。杨保田等[18]研究表明，给奶牛饲喂中草药山楂、橘皮可提高采食量，且采食速度加快，咀嚼次数增加和咀嚼时间增长可使食物得到更充分的研磨，增加了和消化液的接触面积，有利于消化，提高了饲料转换率。

3.3 饲粮中添加葛根素和橙皮苷对热应激条件下锦江黄牛粪便菌群组成的影响

α多样性是指一个特定区域或者生态系统内的多样性，常用的度量标准有Sobs、Chao1、Shannon、Ace、Simpson指数及覆盖度等。Sobs、Ace和Chao1指数反映微生物群落的丰富度，Shannon、Simpson指数反映微生物群落的多样性，Shannon指数越大，Simpson指数越小表明微生物多样性越高。研究发现，在高温刺激下，肠道菌群α和β多样性降低，菌群物种丰富度与数量显著下降[19]。本试验结果显示，与对照组相比，葛根素组的Simpson指数显著下降，橙皮苷组的Sobs、Shannon指数显著升高，Simpson指数显著下降，这提示饲粮中添加葛根素、橙皮苷可能提高粪便菌群的多样性。刘仲昊[20]发现，在育肥猪饲粮中添加500 mg/kg葛根粗提物和500 mg/kg金银花粗提物混合物可提高育肥猪直肠微生物多样性和丰度，改善育肥猪直肠微生物结构，促进益生菌生长和繁殖，并且可以改善育肥猪肠道菌群的代谢功能和微生物表型。Mei等[21]研究发现，橙皮苷能够调节糖尿病模型小鼠肠道微生物群的结构，增加粪便中短链脂肪酸(SCFAs)的含量，这与本研究结果一致。

反刍动物胃肠道内含有大量的微生物，它们在营养物质消化吸收过程中发挥着至关重要的作用。前人的研究结果证实，拟杆菌门和厚壁菌门(Firmicutes)是反刍动物胃肠道主要的优势菌群[22]，与本试验结果一致，且两者之和占比超过90%。拟杆菌门主要降解非纤维类物质，有利于营养成分的消化和吸收[23]。Zhu等[24]研究表明，热应激降低了蛋鸡粪便中厚壁菌门相对丰度而增加拟杆菌门的相对丰度。本试验结果显示，橙皮苷组、复合组的拟杆菌门相对丰度均显著升高，这表明添加橙皮苷和橙皮苷与葛根素的复合物可大大促进热应激锦江黄牛拟杆菌门的增殖，提高肉牛降解非纤维类物质的能力，这与本试验中橙皮苷组和复合组的粗脂肪表观消化率显著提高的结果是一致的。放线菌门具有合成多种结构复杂的酶、抗生素等次生代谢产物的能力，能保护宿主免受病原菌感染[25]。有研究报道，反刍动物瘤胃内的放线菌门和Desulfobacterota的相对丰度均会受热应激的影响而降低[26]。本试验中，葛根素组、橙皮苷组、复合组的放线菌门相对丰度都显著升高，表明添加葛根素、橙皮苷改善了热应激锦江黄牛粪便菌群结构，缓解了肉牛热应激反应。

本试验结果显示，与对照组比较，3个试验组的罗姆布茨菌属相对丰度均显著升高。罗姆布茨菌属属于消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)，专性厌氧菌，具有益生作用，可减轻大鼠的急性胰腺炎症状[27]；常化松等[28]研究表明，黄酮类化合物可以与胃肠道微生物相互作用以改变胃肠道菌群，有针对性地促进胃肠道有益微生物的生长，这可能是3个试验组养分表观消化率提高的原因。理研菌科属于拟杆菌门，与黏蛋白的降解呈正相关，与肠道黏膜健康具有重要作用，对维护肠道健康具有促进作用[29]。周加义等[30]研究发现，高温应激可使畜禽肠黏膜机械屏障功能受损，导致肠道通透性增加，肠黏膜中某些组分改变。本试验中，添加橙皮苷后可提高粪便中理研菌科RC9肠道菌群的相对丰度，这提示橙皮苷对维护反刍动物胃肠健康、促进养分消化利用具有积极作用。

4 结 论

夏季高温高湿环境易导致锦江黄牛出现热应激反应，在饲粮中添加葛根素、橙皮苷可降低锦江黄牛体温和呼吸频率，提高粪便菌群的多样性及有益菌的相对丰度，提高养分表观消化率，缓解锦江黄牛热应激反应。