朱道仙 刘 莉* 王璟琨 郝福星 吴 植 卢劲晔

(1.江苏农牧科技职业学院动物医学院，泰州 225300；2.江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室，泰州 225300；3.江苏农牧科技职业学院宠物科技学院，泰州 225300)

痛风是哺乳动物和鸟类的一种常见代谢病，是一种主要由于高尿酸血症导致尿酸盐结晶在关节、软骨及其他组织中异位沉积引起的炎性疾病[1]。雏鹅对痛风具有易感性，发病率为10%～50%，死亡率高达50%，这严重危害养鹅业的发展[2-5]。大量研究表明，痛风雏鹅发生的肾脏损伤及其导致的肾功能受损甚至衰竭，是雏鹅死亡的主要原因之一[6-8]。深入研究肾脏损伤的分子机制，寻找潜在靶点，对雏鹅痛风的防治具有重要意义。

核苷酸结合寡聚化结构域样受体3(NLRP3)/半胱氨酸天冬氨酸酶-1(Caspase-1)信号通路是一种重要的炎症信号通路，可诱导下游产物白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和白细胞介素-18(interleukin-18，IL-18)的产生与释放，促进肾脏炎症反应[9-11]。研究发现，炎症反应参与高蛋白质饲粮诱导雏鹅痛风的肾脏损伤[12]。然而，这种炎症反应是否与NLRP3/Caspase-1信号通路相关尚不清晰。因此，本研究在饲喂雏鹅高蛋白质饲粮基础上，给予NLRP3特异性抑制剂MCC950进行干预，观察雏鹅生长性能、尿酸代谢及肾脏损伤的变化，探讨NLRP3/Caspase-1信号通路在雏鹅痛风中的作用，为将来生产中以NLRP3为靶点的防控雏鹅痛风新产品的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验设计和饲养管理

选取1日龄扬州雏鹅120只，随机分为3个组，分别为对照组(CON组)、高蛋白质组(HP组)和高蛋白质+MCC950组(HP+MCC950组)，每组5个重复，每个重复8只。对照组饲喂粗蛋白质为16.5%的正常蛋白质饲粮，HP组和HP+MCC950组均饲喂粗蛋白质为24.0%的高蛋白质饲粮，且HP+MCC950组参考廖勇等[13]的方法按10 mg/kg BW剂量腹腔注射MCC950(一种高效的NLRP3抑制剂，购于美国Abmole公司)，每3 d注射1次，其他2组注射等量生理盐水。试验采取双层笼养，试验鹅自由采食与饮水，按正常免疫程序免疫，试验期为15 d。试验饲粮参考NRC(1994)[14]建议的鹅营养需要量标准配制，其组成及营养水平见表1。

表1 试验饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis) %

1.2 测定指标及方法

1.2.1 生长性能

分别于5、10和15日龄时，以重复为单位对试验雏鹅进行空腹称重，计算平均体重，同时记录采食量，计算平均日采食量。

试验结束时，每个重复随机选取3只接近平均体重的雏鹅，颈静脉采血后分离血清并置于4 ℃冰箱中保存，次日检测。血清尿酸(uric acid，UA)含量采用酶比色法测定，血清肌酐(creatinine，Cr)含量采用改良苦味酸法测定，血清尿素氮(urea nitrogen，UN)含量采用脲酶-谷氨酸脱氢酶法测定。

1.2.3 血清炎症因子含量

参考1.2.3方法采血制备血清。按照酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒操作说明，检测血清C-反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、IL-1β、IL-18、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和转化生长因子-β1(TGF-β1)含量，试剂盒均购于Abcam公司。

1.2.4 肾脏组织样本采集

试验结束时，每组每个重复选取1只雏鹅，颈静脉放血致死后，取新鲜肾脏组织若干块，一部分放入4%多聚甲醛溶液中固定用于苏木精-伊红(HE)染色，另一部分放入无水乙醇溶液中用于尿酸盐染色，余下部分装入冻存管置于液氮中用于实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western blot检测。

1.2.5 RT-qPCR检测

采用TRIzol法提取总RNA，定量后使用UEIris RT mix with DNase(All-in-One)试剂盒在37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s条件下逆转录合成cDNA，然后用QuickKing one step RT-qPCR kit(probe)试剂盒按如下条件进行扩增：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循环35次。以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参基因，目的基因mRNA相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。目的基因NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18的引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列见表2。

表2 RT-qPCR引物序列Table 2 Primer sequences for RT-qPCR

1.2.6 Western blot检测

信息技术的发展和互联网的应用与普及，正在深刻影响和潜移默化地改变着每个人的生活和观念，互联网为人们构筑起了一种全新的生活和生存方式。据中国互联网络信息中心(CNNIC)发布的报告显示，截至2011年底，中国网民规模已突破5亿，其中青少年已占据了半数。正如中国青年网执行总编蔺红玉说：“如今的互联网，已经成了青少年的器官，成为他们生命中不可或缺的一部分……”

将100 mg肾脏组织在4 ℃的放射免疫沉淀试验(RIPA)裂解缓冲液中裂解20 min后，在12 000 r/min下离心15 min，收集上清液，并使用二喹啉甲酸(BCA)试剂盒进行蛋白定量。然后取50 μg蛋白用10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)胶将蛋白样品进行电泳分离，再转印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，分别加入兔抗NLRP3(1∶1 000)、Caspase-1(1∶1 000)、IL-1β(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)抗体在4 ℃摇床中孵育过夜。次日，加入山羊抗家兔免疫球蛋白G(IgG)抗体(1∶5 000)室温下孵育1 h后在化学发光成像仪中显影成像。利用Image J软件(1.45)通过光密度测定法对蛋白含量进行量化，以GAPDH作为内部对照将其标准化。所用抗体均购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.2.7 肾脏病理组织学检测

HE染色如下：样本从4%多聚甲醛溶液中取出，脱水，包埋在石蜡中，HE染色，并用中性胶密封，然后在显微镜下观察图像并拍照。参考冯学轩等[15]的方法，采用Gomori六胺银法对肾脏中尿酸盐进行染色，主要步骤为：从无水乙醇溶液取出肾脏组织样本，常规石蜡包埋后制成厚度为5 μm切片，然后浸入Gomori六胺银溶液(60 ℃)30 min，冲洗，浸入氯化金溶液1 min，冲洗，再浸入海波溶液5 min，冲洗，伊红染色液淡染30 s，冲洗后常规脱水透明，中性树胶封固。在普通显微镜下观察图像(尿酸盐呈黑色)，用Image J软件(1.45)计算尿酸盐沉着面积。

1.3 数据处理

试验结果数据以“平均值±标准差”表示，组间数据差异采用SPSS 23.0中的t检验进行比较，采用Pearson相关分析肾脏组织中尿酸盐沉积面积与NLRP3蛋白相对表达量的相关性，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 雏鹅生长性能

由表3可知，随着日龄的增长，对照组、HP组和HP+MCC950组雏鹅的平均日采食量均呈上升趋势，3组同日龄时的平均日采食量之间均无显著差异(P>0.05)。15日龄时，HP组雏鹅的平均体重显著低于对照组(P<0.05)；10和15日龄时，HP+MCC950组雏鹅的平均体重均显著高于HP组(P<0.05)。

表3 雏鹅生长性能Table 3 Growth performance of goslings g

2.2 雏鹅血清生化指标

如图1-A所示，HP组雏鹅血清UA含量显著高于对照组(P<0.05)，HP+MCC950组血清UA含量显著低于HP组(P<0.05)。以人的高尿酸血症临界值420 μmol/L为标准，计算雏鹅的高尿酸血症发病率(图1-B)，可以看出HP组高尿酸血症发病率显著高于对照组(P<0.05)，HP+MCC950组高尿酸血症发病率显著低于HP组(P<0.05)。如图1-C、图1-D所示，HP组雏鹅血清Cr和UN含量显著高于HP组(P<0.05)，HP+MCC950组血清Cr和UN含量显著低于HP组(P<0.05)。

2.3 雏鹅血清炎症因子含量

由表4可知，HP组雏鹅血清CRP、IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α和TGF-β1含量均显著高于对照组(P<0.05)，HP+MCC950组血清CRP、IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α和TGF-β1含量均显著低于HP组(P<0.05)。

表4 雏鹅血清炎症因子含量Table 4 Serum inflammatory factor contents of goslings

2.4 雏鹅肾脏中NLRP3/Caspase-1信号通路相关分子mRNA相对表达量

由表5可知，HP组雏鹅肾脏中NLRP3、Caspase-1、IL-1β及IL-18的mRNA相对表达量显著高于对照组(P<0.05)，分别约为对照组的2.1、2.6、3.6和3.7倍；HP+MCC950组肾脏中NLRP3、Caspase-1、IL-1β及IL-18的mRNA相对表达量显著低于HP组(P<0.05)。

表5 雏鹅肾脏中NLRP3/Caspase-1信号通路相关分子mRNA相对表达量Table 5 mRNA relative expression levels of NLRP3/Caspase-1 signaling pathway related molecules in kidney of goslings

2.5 雏鹅肾脏中NLRP3/Caspase-1信号通路相关分子蛋白相对表达量

如图2所示，HP组雏鹅肾脏组织中NLRP3、Caspase-1及IL-1β的蛋白相对表达量显著高于对照组(P<0.05)，HP+MCC950组肾脏组织中NLRP3、Caspase-1及IL-1β的蛋白相对表达量显著低于HP组(P<0.05)。

*表示与对照组相比差异显著(P<0.05)，Δ表示与高蛋白质组相比差异显著(P<0.05)。下图同。* mean significant difference compared with the CON group (P<0.05),and Δ mean significant difference compared with the HP group (P<0.05).The same as below.图1 雏鹅血清生化指标Fig.1 Serum biochemical indices of goslings

图2 雏鹅肾脏中NLRP3/Caspase-1信号通路相关分子蛋白相对表达量Fig.2 Protein relative expression levels of NLRP3/Caspase-1 signaling pathway related molecules in kidney of goslings

2.6 雏鹅肾脏组织病理损伤

HE染色结果表明，对照组雏鹅肾脏组织结构正常，肾小管清晰(图3-A-a)；HP组肾小管扩张，发生空泡变性、坏死(图3-A-b)；HP+MCC950组肾组织有炎性细胞浸润，肾小管结构较为清晰(图3-A-c)。尿酸盐染色结果表明，对照组雏鹅肾脏组织中几乎无尿酸盐沉积(图3-A-d)，HP组尿酸盐沉积较多(图3-A-e)，HP+MCC950组有少量尿酸盐沉积(图3-A-f)。如图3-B所示，HP组雏鹅肾脏组织尿酸盐沉积面积显著大于对照组(P<0.05)，HP+MCC950组肾脏组织尿酸盐沉积面积显著小于HP组(P<0.05)。Pearson相关分析表明，肾脏组织尿酸盐沉积面积与NLRP3蛋白相对表达量呈显著正相关(r=0.681，P<0.05)。

图3 雏鹅肾脏组织病理损伤Fig.3 Pathological injury in kidney tissues of goslings

3 讨 论

高尿酸血症是一种主要由尿酸合成增多或尿酸排泄障碍引起血液中尿酸含量高于正常值的代谢性疾病[16]。高蛋白质饮食能代谢产生大量嘌呤核苷酸，会增强嘌呤分解代谢，增加尿酸生成，导致高尿酸血症的发生[17]。禽类肝脏中缺乏精氨酸酶，无法将蛋白质代谢产物氨合成尿素，只能通过嘌呤核苷酸代谢途径转化为尿酸，因此高蛋白质饮食更容易增加禽类尿酸的生成，引起高尿酸血症[18]。在本研究中，HP组雏鹅血清尿酸含量显著高于对照组，说明高蛋白质饮食成功诱发雏鹅高尿酸血症，这与相关报道结果[19-21]一致。尿酸在血液中常以阴离子形式存在，饱和度较低，过量尿酸阴离子易析出，与组织中钙离子或钠离子等阳离子形成结晶并沉着在组织中，引发痛风。研究表明，肾脏损伤是雏鹅痛风最突出的器官病变[22]，而且这种肾脏损伤不易康复，可导致雏鹅生长受阻，甚至死亡。本研究结果显示，高蛋白质饮食雏鹅肾小管扩张，发生空泡变性、坏死，且肾脏中尿酸盐沉积面积显著增大，这与李曼曼等[12]对痛风雏鹅的肾脏组织学检查结果相一致。

NLRP3/Caspase-1信号通路主要通过激活NLRP3炎症小体后激发机体免疫反应，清除有害刺激，在机体的固有免疫中起着关键性作用[23]。但持续过度激活可导致多种代谢性疾病(如痛风及肾衰竭)的发生发展[24-25]。研究表明，尿酸盐晶体通过模式识别受体激活NLRP3炎症小体，诱导炎症反应和组织损伤。Yin等[26]研究发现，尿酸可激活NLRP3炎症小体分泌相关炎症因子，进而影响肾脏实质细胞的形态和功能。Hutto等[27]研究表明，NLRP3炎症小体活化加剧了肾脏的炎症和纤维化。在本研究中，高蛋白质饮食雏鹅血清中IL-1β和IL-18等炎症因子含量升高，肾脏组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18的mRNA相对表达量以及NLRP3、Caspase-1和IL-1β蛋白相对表达量均上升，肾小管上皮细胞变性，有大量炎性浸润，而且肾脏组织中尿酸盐沉积面积与NLRP3蛋白相对表达量呈正相关。

MCC950是一种高效的NLRP3抑制剂，可抑制NLRP3/Caspase-1信号通路传导[28]。郭亚净等[29]研究发现，MCC950可以通过抑制NLRP3炎性小体介导的炎症反应和细胞焦亡改善脑出血后的神经损伤。另一项试验研究结果表明，MCC950能够显著抑制高糖环境中HK-2肾小管上皮细胞尿酸介导的NLRP3炎性小体系统效应分子释放[30]。在本研究中，与HP组比较，高蛋白质饮食雏鹅给予MCC950后，肾脏组织中NLRP3、Caspase-1和IL-1β蛋白相对表达量显著降低，肾脏组织结构及肾功能得到改善，血清IL-1β和IL-18等炎症因子以及尿酸含量降低。上述结果表明，抑制NLRP3可改善雏鹅的炎症反应和肾脏损伤，暗示NLRP3/Caspase-1信号通路通过促炎反应引起的肾脏损伤，参与高蛋白质饲粮诱导的雏鹅高尿酸血症及痛风过程。然而，MCC950成本高，给药方式特殊，很难生产实践中应用。下一步将以NLRP3靶点，从来源广、成本低的中草药中筛选出对NLRP3有抑制作用的药物，研究其对雏鹅痛风的保护作用，以便在生产中推广应用。

4 结 论

NLRP3抑制剂MCC950可以通过抑制NLRP3/Caspase-1信号通路减轻高蛋白质饮食雏鹅的炎症反应，改善肾脏损伤，从而降低血清尿酸含量，提高生长性能。