赵小博 余诗强 黄 新 蒋林树

(北京农学院，奶牛营养学北京市重点实验室，北京 102206)

随着动物营养与饲料科学发展需求的不断变化，天然植物的研究得到了业界的重视[1]。我国《饲料原料目录》规定了117种天然植物可作为饲料添加剂来源或饲料原料使用[2]。每种饲用天然植物中含有多种功能组分[3]，这些组分可以在动物机体内发挥抗炎、抗氧化及免疫调节等作用[4]，缓解以自由基稳态失衡主导产生的氧化应激—炎症反应—免疫应激三方联动效应[5]。由于天然植物功能组分结构复杂、功能多样，导致了天然植物功能组分在饲料与饲料添加剂中的利用和发展受到了限制，因此阐明其功能组分-生物学功能-作用靶点关系的机理成为了迫切需要解决的科学问题。在医药学中，通常使用网络生物学方法解决此类复杂机理的研究[6]，如中草药机制的探索[7]、药物与疾病的内在靶点联系等[8]。借助医药领域的生物网络思想，开展饲用天然植物功能组分-生物学功能-作用靶点关系研究意义重大。

1 功能组分-生物学功能-作用靶点关系网络研究现状

1.1 研究方法

1.1.1 网络生物学

网络生物学是一种研究生物网络关系的有利工具，2004年由Barabási等[9]提出，其核心思想是以网络节点的联系为基础，简要说明整个生物反应过程[10]。网络生物学在医药学领域主要用来研究基因、蛋白、生物进化、细胞代谢、麻醉机理、语言科学和大脑神经等一些机理方面的难题[11-14]，在非静态的生物问题中具有独特的优势。由于生物机体的反应是一个动态平衡，特别是在代谢途径、炎症途径、氧化还原以及激素调节方面[15]，大量生物途径在时空尺度上形成了复杂的模式，导致无法对每一个生物反应途径进行剖析研究，即无法使用单一因素预测其行为[16-17]。使用网络学的方法揭示复杂网络中潜在的靶点，并在分子与细胞层面做好疾病的诊断、预后和预防方面的工作成为了网络生物学研究的主要内容[18]。例如利用网络生物学方法发现了很多生命过程中的潜在位点，De Matos Simoes等[19]将BC3Net推理算法应用于333例前列腺癌患者的基因表达谱中，并使用基因富集(GPEA)重点分析了基因的相互作用并为临床研究提供基础。Luo等[20]以天然产物为研究对象，建立了发现抗癌药物的药理学策略。Saint-Antoine等[21]为系统生物推断网络更新了一些先进的算法，讨论了PIDC、Phixer等在癌症研究中的应用。之后的科学研究逐渐发现了网络生物学在识别新的治疗靶点方面的潜力[22]，在药学中发展出了一门针对药理进行研究的学科：网络药理学，并依托数据库的建立和发展，促进了中草药网络药理学的发展。

1.1.2 网络药理学

Hopki于2007年首次提出网络药理学概念[23]。网络药理学是一种阐明药物靶标和疾病蛋白关系的方法[24]。网络药理学的研究思路主要是运用公共数据库对重要的有效成分进行清洗，通过海量靶点信息挖掘真正起治疗作用的关键靶点，并根据关键靶点寻找具有相同影响作用的物质[25]，如图1所示。因为生命系统的复杂性决定了生物学网络状联系的本质，故计算机网络工具解决生物问题具有天然的优势。网络药理学的先进性在于其打破了传统药理研究低生产力的“单一药物、单一靶点、单一疾病”的思想[24]，致力于通过现有的疾病现象和现有的治疗效果，双向寻找其中的关键激活靶点，定性的证明治疗通路是否存在，最终利用其验证通路，实现治疗层面的精准打击[26]。目前，体内的消化和代谢仍然是研究生命科学的一个热点和难点[27]，是很多营养与治疗研究不可避免的干扰因素。网络药理学的一个很重要优势在于其绕过了功能组分在体内消化和代谢的过程，使用了生物利用度和类药性指标代替药物在血液或组织中代谢程度[28]，从数据清洗层面避免了繁重的工作量。目前，该技术已经成为了发现潜在靶点的重要范式[29]，Yang等[30]利用网络药理学找到了玉屏散治疗变应性鼻炎的作用机制；Wu等[31]基于网络的研究方法揭示了钩藤生物碱治疗高血压的作用机制，并发现具有减轻阿尔茨海默病的功能。但是网络药理学的局限性在于，方法只能从物质和表观上判断是否存在生物学通路的定性分析，尚不能开展深层次的了解物质含量是否会引起不同功能的定量研究[26]。因此，网络药理学是一门仅用于评估药物有效性、作用机制以及发现低毒药物的方法[32]，剂量方面尚需要生物学试验进行验证。

图1 网络药理学分析范式 Fig.1 Network pharmacology analysis paradigm[25]

1.2 研究思路

关键作用靶点的挖掘与验证是功能组分—生物学功能—作用靶点关系网络研究的核心工作，如图2所示。从功能组分下游和生物功能上游挖掘共同作用靶点，并且对挖掘到的数据进行数据库验证(蛋白互作)和生物验证[26]，以保证数据挖掘的准确性。最终通过预测手段找出相似化合物再次进入验证，扩增关系网络的数据量。

图2 功能组分-生物学功能-作用靶点关系网络建立思路Fig.2 Establishment of functional component-biological function-action target relationship network[25-26，29]

1.2.1 关键靶点的获取

关键靶点的获取思路与经典的网络药理学相同[33]，都是对已被证实的功能与组分关系进行挖掘。组分与功能存在联系代表着组分进入机体后，所影响的下游靶点会与产生功能的上游靶点相重合，重合部分就可能是组分影响功能的生物学通路。为了挖掘这种潜在联系，首先需要使用数据库获取功能组分和生物学功能的上下游靶点[34]，并对挖掘的数据利用韦恩图进行交集分析，找出潜在靶点。但是，潜在靶点并不一定代表着蛋白之间存在影响关系，没有相互作用的蛋白并不能作为影响生物功能的介质。故需要对潜在靶点进行蛋白互作网络分析(PPI)或通路富集分析，PPI的主要功能就是从数据库中查找蛋白之间是否存在相互作用[35]。通过PPI或通路富集分析验证的靶点称为关键靶点，往往是通过网络学分析得到的关键结果，例如杨凯麟等[36]采用网络药理学方法探究桃仁-红花药在活血化瘀的机制研究中，在数据库挖掘潜在靶点基础上，分别应用Scifinder和PharmMapper搜集和预测化学成分的已知靶点与潜在靶点应用DAVID数据库进行KEGG通路注释分析，最终通过桃仁-红花药对的17个化学成分返回了74个已知靶点，并且已知靶点与改善血流动力学、抗凝血、抗炎、调控细胞凋亡和增殖4个模块有关。徐甜等[37]在基于网络药理学探讨人参茯苓药对治疗老年性痴呆的作用机制中通过TCMSP数据库与DAVID数据筛选出人参-茯苓药对28个活性成分，其中人参22个，茯苓6个；得到89个药物靶点，包括雌激素受体、雄激素受体、孕激素受体、毒蕈碱乙酰胆碱受体M3、毒蕈碱乙酰胆碱受体M1等，其关键靶点的筛查为药物作用机制的探索奠定了基础。

1.2.2 关键靶点的验证

关键靶点的获取来源于数据库比对，得出的结果对分析过程以及数据准确性的依赖很强。所以，数据需要通过通路富集再次进行验证。通路富集验证主要是通过分析通路是否隶属于预期的生物功能范围或相关通路[38]，以确定该条通路或生物过程是否有效。比如，在研究五味子的关键靶点是否对哮喘起作用时，关键靶点的富集生物过程中平滑肌收缩具有很高的显著性，通过病理学认定平滑肌收缩相关功能是导致哮喘的病因之一[39]。Hong等[40]在研究丹参治疗急性/慢性酒精性肝病和非酒精性脂肪肝的作用机制中应用了网络药理学，通过网络分析后找到了丹参中6种潜在的活性成分，富集生物途径中发现与调节脂质代谢，抗氧化剂和抗纤维化有很强的相关，这些生物途径具有保肝的效果，故可认为挖掘的关键靶点与丹参治疗效果相关。李晓晨等[41]利用网络药理学方法研究白花败酱草治疗溃疡性结肠炎的作用机制时，通过数据库分析得到潜在交集靶点，利用String数据库和Cytoscape 3.7.2软件构建药物疾病交集靶点PPI网络，成功地从169个潜在靶点中找到了蛋白激酶B(PKB)是其潜在的核心靶点，并且这些靶点参与的信号通路主要与磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B信号通路有关，这些位点被磷酸化激活后其首要的功能就是激活核转录因子-κB(NF-κB)，并诱导其释放大量的炎性因子如白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等，在病理学中与炎症诱因一致，故可认定该关键靶点与治疗溃疡性结肠炎之间的关联。

1.2.3 关键靶点上游化合物的验证

通过数据库挖掘以及验证关键靶点的方法全程由数据分析完成[42]，需要对关键靶点进行生物性试验验证[43]，以保证结果的可靠性。通常选择与关键靶点相关性最强的化合物作为验证材料开展试验。陈浩等[44]通过数据库比对检索21个栀子活性成分，并富集发现外源化合物代谢、核受体转录、血小板糖蛋白介导激活级联和血小板活化等4条相关的通路，并依此选择栀子水提取物作为大鼠药理试验验证预测药物进行试验，发现栀子水提物能改善胆汁淤积大鼠的血清生化异常，成功验证了网络药理学的机制研究结果；Chen等[45]基于网络药理学对清肺排毒汤进行分析，经过通路验证以及生物途径验证后选择了射干麻黄汤和麻杏石甘汤作为验证方剂，通过生物试验验证发现其是清肺排毒汤最有效的功能单元。因此，关键靶点上游化合物的筛选主要有2个方法：1)通过数据库查找化合物作为验证材料；2)选择具有关键靶点验证的化合物与不含关键靶点验证的化合物作为对比，设计对照试验。选择化合物后，采用细胞试验或生物试验的方法证明化合物具有预期的生物学功能。经过试验验证的化合物可以作为一条新的功能组分-潜在靶点-生物学功能信息。若无预期的试验结果，则否定关键靶点的预测。

1.2.4 通过构效关系模型对关键靶点上游化合物进行预测

定量构效关系(QSAR)来源于药学开发技术[46]，实质上是一种以亚结构为中介挖掘物质与功能关系的数据分析与统计，其原理为找到以结构为单元的共性关系，并依据规律关系进行机理探索和药物开发。定量构效关系就是一种认识部分结构的方法，常用于预测未知化合物的物理化学性质以及通过预期性质来寻找具有相同功效的新成分[47]。关系网络的构建从化学验证试验中确定了一条可以影响生物功能的功能组分，现在根据构效关系的方法可以预测更多的化合物，以获得更多的数据。预测到新的化合物后再次进入生物性试验验证其可靠性。如赵学敏等[48]针对38个喹啉酮类IDH1小分子抑制剂，运用比较分子场法(CoMFA)和相似性指数分析(CoMSIA)研究了该类化合物分子结构与抑制活性的关系，发现该类化合物与蛋白结合主要通过氢键相互作用，根据构效关系模型设计了8个新化合物，所设计的新化合物活性较高。胡义等[49]通过网络药理学发现了甘草黄酮抗痤疮关键成分和靶点后，通过HipHop方法构建了甘草黄铜药效团模型，以结构预测了由1个疏水基团、2个氢键受体基团组成的甘草黄酮最优药效团，建立了甘草黄酮的结构特性与抗痤疮活性之间的构效关系。

1.2.5 关系网络的构建

通过对多个试验得到的功能组分-潜在靶点-生物学功能信息进行分析整合并规范化处理，得到一条标准的“功能组分-潜在靶点-生物学功能”信息，存入MySQL数据库统一管理。达到一定的数据量后，使用Cytoscape软件绘制体系的网络关系图[50]，描述以靶点为节点的饲用天然植物网络关系，形成完备的关系网络挖掘范式，为功能组分的试验提供更多的理论基础。以调节奶牛热应激的天然功能组分挖掘过程为例，形成的关系网络挖掘范式如图3所示。

图3 基于营养调控奶牛热应激的功能组分-生物学功能-作用靶点关系网络挖掘范式Fig.3 Network mining paradigm of functional component-biological function-action target relationship based on nutrient-regulated heat stress in dairy cows

1.3 核心思想

网络药理学是功能组分-生物学功能-作用靶点关系网络的重要研究方法。在营养调控网络中，很多研究尚未解释营养调控和靶点的关系，而网络药理学的核心就是关键靶点的探索，所以二者解决的问题是相似的。网络药理学和关系网络关键点比较见表1。Dancík等[51]通过研究表明，天然植物提取物的靶标高度相关，并更倾向与蛋白质相关，这也为饲用天然植物靶点的网络性提供了理论证明。

表1 网络药理学和关系网络关键点比较Table 1 Comparison of key points between network pharmacology and relationship network[25，34-41]

功能组分-生物学功能-作用靶点关系网络可以为生命调控发现更多的调控因子，找到对生产适合且高效的调控成分，提高生产效益，为科学研究提供方向和思路。功能组分-生物学功能-作用靶点关系网络的应用问题实质上就是潜在靶点的应用问题，因为组分功能关系网络的结果就在于发现营养与功能中的潜在作用，明晰反应的功能原理，所以功能组分-生物学功能-作用靶点关系网络有3个基本的任务：一是通过寻找和挖掘潜在作用靶点，整合生命反应的作用机制，绘制揭示营养调控的综合生物反应网络；二是以其中特殊的生物途径为研究对象，寻找和筛选更多的营养调控物质，推进营养调控物质的研究与发展；三是为植物提取物调控研究提供更多的理论基础。

2 功能组分-生物学功能-作用靶点关系网络在天然植物领域的研究现状

建设植物药物配体-靶网络在动物营养与功能关系中具有很重要意义[52]。可惜的是，很少有研究使用潜在靶点的分析去寻找物质与表观的关系。Gu等[53]曾提出将天然产物作为药物发现和药理学研究的对象应用到化学库中，并对天然产物的分子描述符、化学空间分布和生物活性进行了分析，发现天然产物具有广泛的化学多样性、良好类药性，并且可以与多种细胞靶蛋白相互作用。Fang等[54]重建了具有7 314个相互作用的药物靶标网络，并建立了预测网络模型。并且Fang等[55]在另一篇文章中描述了一个应用系统药理学方法的实例，通过整合天然产物的多元药理学和大规模癌症基因组学数据，在系统生物学框架下研究精确肿瘤学。这些研究的主要内容多为天然产物与靶标之间的关系，且建立了很多数据库[56-59]，但很少涉及生物学功能的研究。一直以来，中草药和植物提取物的研究方法基本落脚于“还原论”和“反向药理法”[60-61]，虽然通过这些方法明确了一些靶点，但是目前植物提取物仍缺乏试验数据。例如，有些植物提取物的研究缺乏可信度的原因在于，其研究没有通过潜在通路和靶点解释植物提取物的表观功效，使得对植物提取物发挥活性的作用机制研究并不明晰，对于植物提取物作用机制的研究结果不信任。尽管植物提取物中的混合物普遍被认为在发挥治疗或功能性作用中优于单物质，但很少有研究讨论其机理，从试验和数据上都不足以支撑这一假说[52]。植物提取物研究结果不稳定的原因有二：其一，植物提取物中成分较多，含量未知，主效因子不明确[62]；其二，不同时期不同产地不同品种的植物中，成分含量与比例较不稳定[63]，缺乏准确客观的重复性验证。所以，功能组分-生物学功能-作用靶点关系网络的研究本质上就是通过靶点分析的方法，反向寻找上游起到作用的分子集团，去除没有进行靶点影响的无效物质，避免上述的两大问题，为植物提取物功能的探究提供新的思路。

3 功能组分-生物学功能-作用靶点关系网络在可饲用天然植物领域面临的挑战

3.1 生命活动的复杂性是影响网络构建的主要障碍

吸收、分布、代谢和排泄是药代动力学的核心[27]，代谢网络的复杂系统扰乱了物质生物学功能的判断。这就为功能组分-生物学功能-作用靶点关系网络的构建带来了很大的障碍。网络药理学的解决方式是通过生物利用度(OB)和类药性(DL)判断物质是否进入到循环系统，从而判定物质是否参与潜在靶点的激活。关系网络研究可以适当借鉴这种方法去解决这个难题。另外需要考虑的是，生物系统行为具有几个基本特性，包括：滞后性、非线性、可变性、相互依赖性、收敛性、弹性和多平稳性[64]。这些基本属性揭示了生物系统的复杂程度，彻底解释生物学功能的机理需要通过消化代谢网络、稳态环境网络、细胞靶点网络等多个复杂系统共同考虑。所以设计功能组分-生物学功能-作用靶点关系网络的研究方案时，务必要考虑到生物系统的复杂性再去设计验证试验等。

3.2 数据的准确性是分析准确的前提

功能组分-生物学功能-作用靶点关系网络和网络药理学的基本原理都是依赖于已有的表型数据库和物质数据库信息，从表观向潜在进行推断和分析，找出相应的靶点，应用于生产或实践。但是如果获取的原始数据缺少科学性和重复性，那么推断出的结果就不具有可信度。另外饲用天然植物功能组分的组成含量在不同的试验研究中均存在一定差异，在不同地区、不同维度、不同的自然地理环境、不同保存方法和时间的饲用天然植物中存在的组分无法达成绝对一致，行业需要规范化组分的标准，才能保证结果的准确性。

3.3 数据库是构建网络分析的重要前提

网络药理学在国内蓬勃发展的原因不只是药学技术的革新，而更多是依赖数据库的建立以及关系网络思想的进步。自2017年中国药科大学正式发布中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)以来[65]，我国对中草药网络药理学的研究呈井喷式增长(图4)。而最早提出网络生物学的研究仍没有太大进展。所以，网络关系的理解和研究很大程度上依赖相关数据库的信息，构建相关的信息库或数据库是进行网络分析的前提。

文章对中国知网上的发文量分析，以“网络生物学”和“网络药理学”作为关键字搜索，并使用中国知网内置分析工具，以年度发文量作为关注度得出以上图示。This paper analyzes the number of articles published on CNKI,using “network biology”and “network pharmacology”as key words,using the built-in analysis tools of CNKI,and taking the annual number of articles published as the attention,to get the above diagram.图4 网络药理学与网络生物在中国知网近些年研究的关注度分析Fig.4 Attention analysis of network pharmacology and network biology research in CNKI in recent years

4 小结与展望

动物营养学的发展是一个长期的过程，学科需要不断提出新的假设和新的验证来丰富行业的内容，使用先进的技术解决营养活性物质机制研究的一大难题[66]。由于网络学发现潜在靶点的功能，研究可以不断地揭示每种物质的作用，为饲料配方提供更多的选择。我国减抗替抗政策施行已3年有余[67]，很多研究都是通过营养与免疫的手段达到减抗替抗的目标。其中，植物提取物和中草药的作用不容小觑[68]。以功能组分-生物学功能-作用靶点关系网络研究为基础，我们期望通过研究植物提取物相关通路，与饲料添加剂的配合去实现更好的营养与免疫效果，甚至配合定量构效关系手段去寻找未发现的营养调控物质，加速营养与功能关系的探索。并且在关系网络的研究方法在一定程度上避免了营养成分加性问题的讨论，由于网络状分析的本质，营养成分之间的组合效应或相互影响被列入分析与计算范围，这与卢德勋先生提出的动物机体三方联动的体系具有思想上的相似性[5]。但目前，营养与功能关系网络的研究仍存在很大缺陷，该方法无法定量预估作用的量级关系，无法做到真正的精准营养，这是未来发展过程中仍要解决的问题和探索的方向。