许 滢，冯 涛，王化田，宋诗清，姚凌云，孙 敏，柳 倩，于 闯

（上海应用技术大学香精香料化妆品学院，上海 201400）

佛手柑（Citrus medicaL.var.sarcodactylis Swingle）又称佛手、佛手香橼、蜜筩柑、蜜罗柑、福寿柑、五指柑等，是柑橘属香橼种植物[1]，主要种植在我国的浙江、江西、福建、广东、广西、四川、云南等地。佛手柑果实形状呈卵形或长圆形，果实前端分裂如拳状，或张开似指尖[2]。佛手柑具有一定的药理价值，对肠道、脾胃和心血管疾病等有一定的治疗作用，兼具一定的抗炎、抗病毒作用[3-7]。

佛手柑因其特殊的香气和药理作用被广泛研究。Song 等[8]通过顶空固相微萃取（headspace solid phase microe-xtraction，SPME）和气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）对金华佛手柑果肉和果皮的挥发性成分进行检测，并通过最小偏二乘法进行分析，确定金华佛手的主要香气物质是柠檬烯、α-蒎烯、β-蒎烯、辛酸乙酯、芳樟醇、柠檬醛、叶醇和香茅醇等。目前对于佛手柑的研究主要涉及对单一产地或品种佛手柑香气成分的分析与鉴定，及其抗菌等药理特性研究[3,9-10]，而对佛手柑不同产地不同品种不同香气质量评价的研究鲜有报道。因此，研究不同产地佛手柑的特征香气，对今后佛手柑的育种栽植和产品开发具有一定的理论支持。

目前，物质香气提取的方法有很多，常见的有液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）[11]、溶剂辅助蒸发萃取（solvent-assisted flavor evaporation，SAFE）[12]、顶空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）[13]等。其中LLE 可以较全面地提取香气成分，但存在样品用量大、耗时长等缺点；SAFE 是一种在真空低温条件下的提取方法，能对低挥发性成分进行高效提取，可以真实反映原有的风味组分，但是存在操作繁琐、耗时长等问题。而HS-SPME 技术是佛手柑香气物质提取的常用技术，具有操作简便快捷、香气成分损失较少、灵敏度高等优点[13-15]，再通过相对气味活度值（relative odor activity value，ROAV）公式，可以快速筛选检测物质的关键挥发性成分。郝旭东等[16]采用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱（HS-SPME-GC-MS）、ROAV 分析确定大红袍花椒的主体风味物质，结果表明烃类、醇类和酯类对四种花椒主体香气贡献最大，芳樟醇、3-蒈烯、乙酸香叶酯、月桂烯对大红袍花椒整体香气贡献度最大。因此，本研究采用HS-SPME-GC-MS 技术对佛手柑的挥发性物质进行检测分析，同时结合ROAV 分析方法确定佛手柑的关键性风味物质。

本试验首先通过HS-SPME-GC-MS 检测鉴定佛手柑的挥发性物质成分，随后查阅相关物质的阈值和香气特征，通过ROAV 计算，快速筛选出佛手柑中的关键挥发性物质，通过主成分分析讨论不同地区佛手柑挥发性物质的香气特征，为不同产地佛手柑筛选提供理论依据，同时为各地佛手柑产品开发提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验材料全部由金华农业科学院finger citron 研究所提供，是在成熟期采摘的新鲜佛手柑。试验的佛手柑品种有三种，分别是浙江金华佛手柑（金佛手，JFC）、广东佛手柑（广佛手，GFC）、云南佛手柑（滇佛手，DFC）。

C8～C30系列烷烃，分析纯，美国Sigma Aldrich 公司。

1.2 仪器与设备

7000D 三重四级杆气相色谱-质谱联用仪，美国安捷伦公司；HP-5MS 色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），美国色谱科公司；30/50 CAR/DVB/PDMS 萃取头，美国色谱科公司；数显恒温水浴锅，国华电器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 HS-SPME

为保证萃取头的可靠性，先将萃取头在250 ℃下老化30 min。将新鲜的佛手柑切碎，每个品种称取一定量样品于20mL顶空瓶中，约占瓶身1/3 处，随后密封置于60℃恒温水浴锅中，用萃取头吸附30 min。最后将萃取头插入GC-MS 进样口解析5 min。

1.3.2 GC-MS

采用HP-5MS毛细管色谱柱（30m×0.25mm×0.25μm），进样口温度250 ℃，载气为氦气，流速保持在1.0 mL/min，不分流，溶剂延迟5 min。升温过程：初始温度40 ℃保持3 min，以3 ℃/min 升温至100 ℃，最后以5℃/min 升温至230℃，保持20min。

质谱条件：采用电子电离源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，接口温度250 ℃，采用全扫描方式，质量扫描范围20～3 350m/z。

1.4 香气成分的定性和定量分析

1.4.1 定性分析

原始数据在Nist11 数据库中进行匹配定性，选择匹配度大于90%的挥发性物质[17]。计算化合物的保留指数值，与查询的保留指数记录进行对比定性。保留指数计算如公式（1）所示。

式中，ta为色谱峰a的保留时间；tn、tn＋1为正构烷烃Cn和Cn＋1的保留时间。

1.4.2 定量分析

根据峰面积归一化法计算佛手柑中各挥发性化合物的相对含量[18]。计算公式见式（2）。

式中，M为单个组分香气物质的峰面积；N为总体峰面积。

1.5 ROAV 法确定佛手柑主体风味物质

参照ROAV 法对佛手柑中的挥发性风味物质的贡献大小进行评价，进而确定主体风味物质[19]。定义对佛手柑样品总体风味贡献最大的组分：ROAVmax＝100，其他的组分a。计算公式见式（3）。

式中，Ca为挥发性组分的相对含量，%；Ta为挥发性组分的感觉阈值，μg/kg；Cmax为对样品总体香气贡献度最大挥发性组分的相对含量，%；Tmax为对样品总体香气贡献度最大挥发性组分的风味阈值，μg/kg。

1.6 数据分析

气相色谱分析采用Nist11 数据库，采用Microsoft Excel 2016 进行数据处理，采用TBtools 进行热图绘制，采用Origin 2022 绘制PCA 图和雷达图。

2 结果与分析

2.1 佛手柑挥发性成分分析

采用HS-SPME 提取佛手柑的挥发性物质，并用GC-MS 分析，结果表明3 个地区的佛手柑品种共检出77 种挥发性风味物质，结果见表1，将这些数据筛选处理，绘制成分含量热图（图1），以便直观地进行比较分析。

图1 佛手柑挥发性物质含量热图Fig.1 Heat map of volatile substance content of finger citron

由表1 可知，烃类物质在佛手柑中含量占比较大，共检测出49 种烃类物质，其次是醛类和醇类，分别检测出10 种和8 种。这与Wang 等[20]对佛手柑的检测基本一致。金佛手中检测出48 种挥发性物质，d-柠檬烯的含量最高（35.55%）；广佛手中检测出31 种挥发性物质，d-柠檬烯（11.06%）和双戊烯（11.59%）含量最高；滇佛手中检测出47 种挥发性物质，d-柠檬烯（23.84%）和双戊烯（24.87%）含量最高。广佛手的挥发性物质种类显著少于另外两种佛手柑。

表1 佛手柑挥发性物质的相对含量Table 1 Relative content of volatile substances in finger citron

续表

续表

14 种挥发性物质在三个产地的佛手柑中均被检测出，分别是α-蒎烯、β-蒎烯、d-柠檬烯、双戊烯、香树烯、(-)-α-荜澄茄油烯、石竹烯、金合欢烯、δ-杜松烯、壬醛、橙花醛、十一醛、香叶醇、异亚丙基丙酮。16 种挥发性物质仅在金佛手中检测出，其中罗勒烯（1.773%）、左旋-α-蒎烯（4.196%）含量相对较高，高于1%；11 种挥发性物质仅在广佛手中检测出，物质百分含量普遍较低，全部低于1%；17 种挥发性物质仅在滇佛手中检测出，其中，3-蒈烯（5.799%）、1,5-二甲基-1,5-环辛二烯（5.063%）含量相对较高。

2.2 佛手柑关键挥发性风味物质的分析

2.2.1 ROAV 分析

前期在佛手柑中检测出了多种挥发性风味物质，其中一部分关键挥发性物质对佛手柑的整体风味贡献较大，其余挥发性物质对佛手柑整体风味的呈现只起到修饰和协同作用。挥发性风味物质对佛手柑风味特征的贡献大小主要由其相对含量和香气阈值决定。所以，查询了77 种挥发性成分的风味阈值，共找到37 个化合物的阈值，对查询到阈值的挥发性物质进行了ROAV 计算（见下页表2）。ROAV≥1 的物质对样品香气贡献较大，为关键性香气化合物，并且ROAV 值越大的物质对样品总体风味的贡献也越大[16]。

由表2 可以看出，三个产地佛手柑共有的关键挥发性物质有α-蒎烯、β-蒎烯、d-柠檬烯、双戊烯、石竹烯、壬醛、橙花醛、十一醛和香叶醇。α-蒎烯和β-蒎烯主要表现为木香和草香，d-柠檬烯、双戊烯和橙花醛表现为柑橘柠檬类香气，石竹烯和香叶醇主要为佛手柑主体香气提供花香和蜜甜香，十一醛和壬醛则具有一定油脂气息。此外，金佛手特有的关键香气物质有蒎烯、左旋-α-蒎烯和癸醛；广佛手特有的关键香气物质有(Z)-3,7-二甲基辛-2,6-二烯醛；滇佛手中没有找到特有的关键香气物质。金佛手中，d-柠檬烯的ROAV 值最高，为100，其次是香叶醇、芳樟醇和月桂烯，主要香气特征表现为柑橘果香，辅助香气为花香、木青香和辛香；广佛手中，香叶醇的ROAV 是主要风味贡献物，其次是d-柠檬烯，ROAV值为38.178，主要香气特征表现为浓郁的柑橘果香，辅以花香修饰；滇佛手中，香叶醇是最大的风味贡献化合物，同时芳樟醇的ROAV 值也高达76.950，提供木香和草香的青气。

表2 佛手柑中挥发性物质及其ROAV 值Table 2 Volatile substances and their ROAV values in finger citron

2.2.2 PCA 和风味雷达图

为进一步研究关键挥发性风味物质对佛手柑风味的影响，对佛手柑中ROAV≥1 的16 种香气物质进行主成分分析，结果如图2（见第41 页）所示。PC1（60.5%）和PC2（39.5%）的累计贡献率达到100%，月桂烯（F6）和萜品烯（F7）是PC1 中正向载荷值最高的，香叶醇（F27）是PC1 中负载荷值最高的，α-蒎烯（F3）是PC2 中正向载荷值最高的，萜品油烯（F11）是PC2 中负载荷值最高的，说明这些化合物对佛手柑的主体香气贡献最大。对这16 种关键香气物质进行风味雷达图构建（见第41 页图3），金佛手的主体香气是柑橘香，修饰香气是花香、木青香和香脂气息；广佛手的主体香气是花香，修饰香气是柑橘香；滇佛手主体香气是花香和木青香，修饰香气是柑橘香。

图2 佛手柑关键挥发性物质主成分载荷图Fig.2 Principal component loadings for key volatiles in finger citron

图3 不同产地佛手柑的香气雷达图Fig.3 Aroma radar map of finger citron from different regions

3 结论

本文采用HS-SPME-GC-MS 技术对三个不同产地佛手柑的挥发性物质进行检测分析，旨在筛选佛手柑的关键香气挥发物。研究共检测出挥发性物质77 种，发现佛手柑中烃类化合物占比最大，其次是醛类和醇类，其中有14 种共有成分。通过查找阈值对挥发性物质进行ROAV 计算，筛选出ROAV 值≥1 的关键香气成分，共找到22 种关键挥发性物质，其中佛手柑中共有的关键挥发性物质有α-蒎烯、β-蒎烯、d-柠檬烯等。佛手柑的主体香气主要是柑橘果香、蜜甜香、花香和青香。金佛手特有的关键香气有蒎烯、左旋-α-蒎烯和癸醛；广佛手特有的关键香气有(Z)-3,7-二甲基辛-2,6-二烯醛；而滇佛手中没有找到特有的关键香气，这些特征香气物质可以作为区分不同产地佛手柑的参考依据。最后对16 个关键挥发性物质进行主成分分析，发现月桂烯、萜品烯、香叶醇、α-蒎烯和萜品油烯对佛手柑的主体香气贡献最大。通过香气雷达图确定金佛手的主体香气是柑橘香，广佛手的主体香气是花香，而滇佛手主体香气是花香和木青香。本研究为三个产地佛手柑的筛选区分以及后续产品的开发应用提供一定的参考依据。