黄海辰 李晓敏，2 薛帆正 吴小平，2 张君丽 傅俊生，2

（1.福建农林大学生命科学学院，福州 350002；2.福建农林大学菌物研究中心，福州 350002；3.西藏自治区农牧科学院蔬菜研究所，拉萨850000）

天然黑色素（melanin）是由吲哚与酚类化合物氧化聚合而成，在自然界中分布广泛［1］。黑色素主要分为真黑素（eumelanin）、棕黑素（pheomelanin）、异黑色素（allomelanin）三大类，真菌黑色素主要存在真黑素［2］。研究表明，黑色素具有化学抗氧化［3］、保肝［4］、抗炎［5］、抑菌［6］、抗病毒［6］、抗辐射［7］等生物活性。黑色素来源广泛，微生物来源的黑色素主要有链霉菌、假单胞菌、粒毛盘菌、黑木耳、平菇等，但产量不足以满足大规模应用［8-9］。香灰菌是银耳的伴生菌，在银耳菌棒中广泛存在，银耳菌棒中的黑色素也鲜少报道。

香灰菌来源的黑色素具有生长周期快、成本低等优势。彭卫红［10］和罗青等［11］研究发现，不同来源的香灰菌对碳源和氮源的利用能力存在显著差异，且在不同培养基、pH 以及光照等条件下香灰菌菌丝生长速度及菌落形态明显不同，黑色素产量也不尽相同，但尚未对其营养配方进行系统的优化。本研究对11 个不同来源的供试菌株进行鉴定，以菌丝生长速度、平板L 值、发酵液黑色素含量等指标筛选一株产黑色素能力强的香灰菌，并探究不同培养条件对香灰菌菌丝生长及黑色素产生的影响，使优化后的培养基更有利于黑色素的合成。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 菌株编号为Hp.sp0001、Hp.sp0002、Hp.sp0003、Hp.sp0006、古田AS 及古田AS（新）的菌种来自福建农林大学菌物研究中心；菌株编号为川灰、河南、香灰3、白灰的菌种由古田县食用菌种植户提供；菌株编号为黄耳香灰的菌种为本实验室研究用菌株。

1.1.2 主要试剂 真菌DNA 提取试剂盒、Bioteke 2×power Taq PCR Master Mix 试剂盒，购自OMEGA公司；葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁等常用试剂均为国产分析纯。

1.1.3 供试培养基 PDA 加富固体培养基（g/L）：琼脂 20，土豆 200，蛋白胨 5，KH2PO42，MgSO4·7H2O 1.5，VB10.01；PDB 加富液体培养基（g/L）：土豆 200，蛋白胨 5，KH2PO42，MgSO4· 7H2O 1.5，VB10.01。

1.2 方法

1.2.1 黑色素含量测定 参照张玉彬［12］和曾昌巧等［13］的方法，用Lab 色度系统来反应香灰菌黑色素含量，其L 值表示亮度，值越大，颜色越偏向白色；反之，L 值越小，则说明颜色越偏向黑色，此方法可直观测定菌株黑色素的产生情况。

1.2.2 菌丝生长速度测定及黑色素提取 将同期活化的11 种供试菌株，接种菌龄及大小相同的菌块于PDA 培养基中，置于24℃培养箱恒温培养，每天记录菌丝生长情况，利用十字划线法测量菌丝生长速度，并观察菌落的形态及黑色素产生情况。

参照吴尧等［14］的方法，分别接种7 片直径为0.7 cm 的11 种供试香灰菌于装有100 mL 的PDB 加富培养基中，每个菌株设置3 个生物学重复，置于24℃，160 r/min 摇床黑暗培养10 d。培养结束后，过滤收集滤液，加入等量的1 mol/L NaOH，100℃水浴提取3 h。待水浴结束后，10 000 r/min 离心3 min，取上清液，使用1 mol/L HCl 将上清液pH 调到2.0，10 000 r/min 离心5 min 收集沉淀，即得黑色素粗品。

1.2.3 产黑色素香灰菌菌株的分子鉴定 分别接种11 个供试菌株，24℃培养10 d 后，收集菌丝备用。采用OMEGA 真菌DNA 提取试剂盒提取香灰菌的DNA。

采用Bioteke 2×power Taq PCR Master Mix 试剂盒扩增12 株供试菌株ITS 区序列，以真菌核糖体基因间隔区通用的ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTGATATGC-3'）为引物［15］。PCR 反应体系（25 μL）为：2×Taq 酶12.5 μL；ddH2O 9.5 μL；ITS1 和ITS4 引物各1 μL；模板1 μL。反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，共32 个循环；72℃终延伸10 min，4℃ 保存。用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR 扩增产物进行质检，将产物送至厦门擎科生物技术有限公司测序。

将测序得到的DNA 序列在GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中进行同源比对分析，下载同源性较高的Annulohypoxylon stygiumKP995421.1、Annulohypoxylon stygiumFJ848865.1 和Annulohypoxylonsp.MW862791.1 的序列作为比对时的参考菌序列，采用邻接法（Neighbor-Joining）构建系统发育树，自展法（Bootstrap）检验重复1 000 次，以检验分子进化树的可靠性，剖析各菌株之间的遗传关系。

1.2.4 高产黑色素的平板培养配方优化 以香灰菌平板产黑色素的情况（L 值）和菌丝生长速度为指标，探究培养基碳源（无碳、果糖、甘露醇、淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、木糖、玉米粉），氮源（无氮、酵母提取物、胰蛋白胨、牛肉浸膏、硝酸钾、硝酸铵、酒石酸铵、脲），碳氮比（5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1，50∶1、60∶1 和70∶1），维生素（无维生素、硫胺素VB1、核黄素VB2、VB6、叶酸VB9、抗坏血酸VC、生物素VH、尼克酸VPP），pH（5、5.5、6、6.5、7、7.5、8）5 个单因素对香灰菌产黑色素的影响。

1.2.5 正交试验 为了探究香灰菌产黑色素的最优培养条件，进一步对上述单因素试验结果进行正交优化。以L 值为指标，从中选择碳源、氮源、碳氮比和pH 单因素进行3 水平4 因素的正交试验，如表1所示，每个分组设定3 个重复。

表1 正交试验因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.6 统计分析 用SPSS 23.0 统计软件进行数据显著性方差分析。采用t检验分析两组显著性，P<0.05表示差异显著，P<0.01 差异极显著。

2 结果

2.1 供试菌株的分子鉴定

通过ITS 分子鉴定对11 株供试菌株进行检测，测序后在NCBI 上进行比对，选取相似度较高的序列作为参考菌序列。结果表明11 株菌株均为属于暗色环纹炭团菌（Annulohypoxylon stygium）。如图1所示，Hp.sp0001、Hp.sp0002 和古田AS、河南香灰的亲缘关系较近，Hp.sp0006 和白灰、川灰的亲缘关系较近，Hp.sp0003 和古田AS 新的菌株处在同一分支，表明亲缘关系较近。

图1 11 株供试菌株的系统发育进化树Fig.1 Phylogenetic tree of 11 tested strains

2.2 产黑色素菌株的筛选

2.2.1 香灰菌菌丝体形态比较 基于菌株形态水平，实验首先对11 株供试菌株的菌丝生长速度、菌球形态和平板L 值进行比较。Lab 系统可分为L（亮度）、a 和b，a 表示红绿轴，b 表示黄蓝轴。我们通过色差仪对平板进行测量，色差仪测量后会显示出L、a、b、ΔL、Δa、Δb、ΔC、Δh、ΔE 等数值，我们可以根据测出的L 值进行比较，L 值为0 时代表黑，L 值为100 时代表白。由图2可知，在相同条件下，不同香灰菌菌株的菌丝生长速度和产黑色素情况差异较大，菌丝体形态和菌球形态各异。其中，Hp.sp0006、白灰、黄耳香灰、古田AS、Hp.sp0002平板L 值较低。Hp.sp0006 菌丝健壮、生长速度较快且平板L 值最低。白灰菌丝和古田AS 菌丝致密健壮，平板L 值较低且菌丝生长速度较慢。黄耳香灰菌丝稀疏，菌丝生长速度较慢，平板L 值也不高。Hp.sp0002 菌丝洁白纤细，平板L 值较低，菌丝生长速度较快。另外，香灰3 菌丝稀疏纤细、洁白，平板L 值高。初步综合分析，Hp.sp0006 生长及产黑色素潜能优良。

图2 11 株香灰菌菌丝形态及其菌丝生长速度、色度分析Fig.2 Analysis of mycelial morphology and mycelial growth rate and chromaticity of 11 strains of Hypoxylon sp.

2.2.2 香灰菌发酵液黑色素含量比较 实验继续探究11 株香灰菌发酵液黑色素含量，如图3-A 所示，在相同条件液体发酵下，11 株香灰菌菌株发酵液黑色素含量差别较大。如图3-B 所示，Hp.sp0006 菌球大且均匀，呈棕黄色，发酵液含量最高可达0.77 g/L。白灰菌球较小。黄耳香灰菌菌球较小，发酵液黑色素含量较高。古田AS 菌球较大。Hp.sp0002 菌球大小不均匀，黑色素含量也不高。河南香灰菌球浅棕色，发酵液黑色素含量最低。综上，初步筛选获得一株高产黑色素香灰菌菌株Hp.sp0006。

图3 11 株香灰菌发酵液黑色素含量及菌球形态Fig.3 Melanin content and spheroid morphology in fermentation broth of 11 Hypoxylon sp.

2.3 高产黑色素香灰菌菌株Hp.sp0006的平板培养优化

2.3.1 不同碳源对菌丝生长及产黑情况的影响 以PDA 加富固体培养基作为基础培养基，以不添加碳源为对照，探究碳源对Hp.sp0006 香灰菌菌丝生长速度和菌丝体产黑色素的影响。如图4-A 所示，与对照组相比，用淀粉作为培养基碳源显著（P<0.05）地提高了菌丝生长速度，用果糖、甘露醇、乳糖、蔗糖、葡萄糖、木糖、玉米粉作为培养基碳源极显著（P<0.01）地提高了菌丝生长速度，其中以甘露醇作为碳源菌丝生长速度最快。如图4-B 所示，与对照组相比，Hp.sp0006 香灰菌在不同碳源上产黑色素均极显著（P<0.01），其中以果糖作为培养基碳源，平板L 值最低。如图4-C 所示，考虑到以甘露醇为碳源时，菌丝徒长，平板转黑不明显；以果糖作为碳源时，菌丝体产黑色素不均匀、不稳定，因此选择葡萄糖作为培养基碳源。

图4 不同碳源对香灰菌 Hp.sp0006 菌丝体产黑色素的影响Fig.4 Effects of different carbon sources on the produced melanin by mycelium of Hp.sp0006

2.3.2 不同氮源对菌丝生长及产黑情况的影响 以PDA 加富固体培养基作为基础培养基，碳源为葡萄糖的条件下，以不添加氮源为对照，探究培养基氮源对Hp.sp0006 香灰菌菌丝生长速度和菌丝体产黑色素的影响。如图5-A 所示，与对照组相比，用牛肉浸膏、硝酸钾、硝酸铵作为培养基氮源显著提高了菌丝生长速度，用胰蛋白胨、脲作为培养基氮源极显著提高了菌丝生长速度，其中以胰蛋白胨作为氮源菌丝生长速度最快。如图5-B 所示，与对照组相比，Hp.sp0006 香灰菌在以酵母提取物、胰蛋白胨、牛肉浸膏、硝酸钾、硝酸铵、酒石酸铵作为氮源的培养基上产黑色素极显著，其中以牛肉浸膏为培养基氮源，平板L 值最低。因此，选择牛肉浸膏作为培养基氮源较为合适。

图5 不同氮源对香灰菌Hp.sp0006 菌丝体产黑色素的影响Fig.5 Effects of different nitrogen sources on the produced melanin by mycelium of Hp.sp0006

2.3.3 不同碳氮比对菌丝生长及产黑情况的影响 以PDA 加富固体培养基作为基础培养基，碳源为葡萄糖、氮源为牛肉浸膏的条件下，以碳氮比5∶1为对照，探究培养基碳氮比对Hp.sp0006 香灰菌菌丝生长速度和菌丝体产黑色素的影响。如图6-A 所示，与对照组相比，培养基碳氮比10∶1 显著提高了菌丝生长速度，碳氮比30∶1 极显著提高了菌丝生长速度，其中碳氮比10∶1 时菌丝生长速度最快。如图6-B 所示，与对照组相比，Hp.sp0006 香灰菌在碳氮比60∶1 的培养基上产黑色素显著，碳氮比30∶1、50∶1 的培养基上产黑色素极显著，其中碳氮比10∶1 时平板L 值最低。因此，选择培养基碳氮比10∶1 继续进行优化较为合适。

图6 不同碳氮比对香灰菌Hp.sp0006 菌丝体产黑色素的影响Fig.6 Effects of different carbon nitrogen ratio on the produced melanin by mycelium of Hp.sp0006

2.3.4 不同维生素对菌丝生长及产黑情况的影响 以PDA 加富固体培养基作为基础培养基，碳源为葡萄糖、氮源为牛肉浸膏，碳氮比为10∶1 的条件下，以不添加维生素为对照，探究维生素对Hp.sp0006 香灰菌菌丝生长速度和菌丝体产黑色素的影响。如图7-A 所示，与对照组相比，维生素对菌丝生长速度的影响不显著。如图7-B 所示，与对照组相比，Hp.sp0006 香灰菌在核黄素VB6作为生长因子的培养基上产黑色素显著，在硫胺素VB1、叶酸VB9、抗坏血酸VC、生物素VH、尼克酸VPP 作为生长因子的培养基上产黑色素极显著，其中用硫胺素VB1作为生长因子时平板L 值最低。因此，选择硫胺素VB1为生长因子继续进行优化较为合适。

图7 不同维生素对香灰菌Hp.sp0006 菌丝体产黑色素的影响Fig.7 Effects of different vitamin on the produced melanin by mycelium of Hp.sp0006

2.3.5 不同pH 对菌丝生长及产黑情况的影响 以PDA 加富固体培养基作为基础培养基，以葡萄糖为碳源、牛肉浸膏为氮源，碳氮比10∶1，维生素为硫胺素VB1条件下，以自然情况下的培养基pH 为对照，经测定自然情况下培养基pH 为6.4，探究pH 对Hp.sp0006 香灰菌菌丝生长速度和菌丝体产黑色素的影响。如图8-A 所示，与对照组相比，培养基pH 为7.5 时显著降低了菌丝生长速度，表明香灰菌可能不宜在中性偏碱条件下生长。如图8-B 所示，与对照组相比，Hp.sp0006 香灰菌在pH 为5.0 的培养基上产黑色素显著。因此，选择培养基pH 为5继续进行优化较为合适。

图8 不同pH 对香灰菌Hp.sp0006 菌丝体产黑色素的影响Fig.8 Effects of different pH on the produced melanin by mycelium of Hp.sp0006

2.3.6 正交优化 基于以上单因素试验结果，选择碳源、氮源、碳氮比、pH 这4 个单因素进行4 因素3 水平正交试验，进一步对Hp.sp0006 香灰菌菌株培养条件进行优化。

通过极差分析法（表2）可知，影响香灰菌产黑色素的主次关系为氮源>pH>碳氮比>碳源，表明氮源是影响香灰菌产黑色素的主要因素（图9）。方差结果分析（表3）显示，氮源有极显著影响（P<0.01），碳氮比有显著影响（P<0.05），碳源和pH 没有显著影响。从表中可知，当氮源为牛肉浸膏、碳源为葡萄糖时，平板L 值会较碳源为果糖和蔗糖时低，故碳源选为葡萄糖。由k 值大小确定香灰菌产黑色素的最优配方为A1B1C3D3，即碳源为葡萄糖、氮源为牛肉浸膏、碳氮比为20∶1、pH 为6 时，香灰菌产黑色素的含量最高。

图9 正交试验中平板菌丝体生长状况Fig.9 Growth status of the mycelium of Hp.sp0006 in orthogonal test

表2 香灰菌平板L 值正交试验结果直观分析Table 2 Analysis of the orthogonal test result of the L value of Hp.sp0006

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

2.3.7 验证实验 根据优化后的配方进行验证实验，进一步探究最优配方的可靠性。碳源为葡萄糖、氮源为牛肉浸膏、碳氮比为20∶1、pH 为6、转速为160 r/min 时，进行液体发酵10 d，抽滤收集滤液进行提取黑色素。经干燥后称重计算得率，黑色素含量可达（1.21±0.17）g/L，与未优化相比具有显著差异，与优化前相比提升了1.61 倍，具有显著差异，表明优化后的配方可行（图10）。

图10 正交实验最优组合液体发酵的黑色素含量Fig.10 Orthogonal experiment for optimal combination of liquid fermentation for melanin content

3 讨论

近年来，研究表明真菌黑色素具有良好的抗氧化、清除自由基、抗炎、抑菌抗肿瘤等生物活性，在农业、工业、化妆领域、医药等方面得到广泛的应用。已有研究表明黑色素在生物农药光保护剂、天然色素、防晒霜、染发剂等方面已有开发应用［16-18］。但目前由于黑色素的产量较低，限制了它的应用。微生物具有易培养、生产快等优势。香灰菌是银耳的伴生菌，会分泌黑色素，且香灰菌黑色素有非常明显的氧化还原能力［19］。利用真菌发酵产黑色素，可以较快速获得黑色素。大量研究发现，真菌菌株生长和次生代谢产物的合成会受到外界温度、光照的影响，培养基提供真菌生长所需的营养条件，对其生长代谢影响较大。适宜的外部环境不仅有利于菌体的生长，还能提高菌株对底物的利用能力，使代谢向着有利于目的产物合成的方向进行［14］。本研究结果表明，同一种属的不同菌株在相同培养条件下，菌丝生长，菌球形态及产黑色素情况并不相同。ITS 测序可用于真菌属种水平上的条形码鉴定及系统发育分析，具有操作简单、快速、准确等优势［20-22］。本研究采用ITS 测序对供试菌株进行鉴定，结果表明11 株供试菌株均为香灰菌Annulohypoxylon stygium。其中Hp.sp0006 在PDA 加富培养基上菌丝生长迅速，平板L 值低且产黑色素较好，表明Hp.sp0006 可能是受遗传物质影响，具有生物特性较佳的菌株。

不同的香灰菌分泌黑色素的情况也不尽相同，筛选出一株稳定的高产黑色素的香灰菌菌株，并获得其最优培养配方十分有意义。本实验通过平板培养，以菌丝生长速度、菌球形态、平板L 值、黑色素含量为指标，从碳源、氮源、碳氮比、维生素、pH 等5 个因素探究香灰菌高产黑色素的最佳配方。筛选出一株香灰菌菌株Hp.sp0006，并在此基础上对Hp.sp0006 的最优培养配方进行探究，筛选适合香灰菌Hp.sp0006 产黑色素的碳源、氮源、碳氮比、维生素等，在进行单因素优化实验时，单因素筛选时发现在碳源为葡萄糖，氮源为牛肉浸膏，维生素为VB1，碳氮比为10∶1，pH 为5 时，Hp.sp0006 菌丝健壮，平板L 值低，黑色素产量高。正交实验结果表明Hp.sp0006 香灰菌菌株菌丝生长和高产黑色素的平板培养最适培养条件为：碳源为葡萄糖，氮源为牛肉浸膏，碳氮比为20∶1,pH 为6。Zhao 等［23］的研究表明，添加外源的硝普纳（SNP）可以促进真菌Stemphyliumeturmiunum 黑色素的生物合成，NO可能通过NO-sGC-GMP 信号通路调节S.eturmiunum的生长和黑色素合成。在香灰菌培养基中添加外源的SNP 可能也是我们今后的研究方向。

4 结论

从11 株香灰菌Annulohypoxylon stygium中筛选出一株高产黑色素香灰菌菌株Hp.sp0006。确定Hp.sp0006 香灰菌菌株高产黑色素平板培养的最佳培养配方：碳源为葡萄糖、氮源为牛肉浸膏、碳氮比20∶1、维生素为VB1，pH 为6，在此条件下，液体发酵液中黑色素含量为（1.21±0.17）g/L,为香灰菌黑色素的开发与利用奠定了基础。