沈文婷，秦建品，许 诣

（湖北文理学院附属医院/襄阳市中心医院儿科，湖北 襄阳 441021）

气道平滑肌细胞（ASMCs）的增殖和分泌物的增加已被认为是哮喘等阻塞性肺疾病的致病因素，其过度增殖可导致气道阻塞和支气管收缩障碍，目前为止还没有能够有效抑制其增殖的方法[1]。因此有必要研究抑制ASMCs增殖的机制。细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase 1/2，ERK1/2）在哮喘中的激活是ASMCs细胞增殖和气道重塑的主要调节剂，抑制其激活可抑制ASMCs细胞增殖和减缓气道重塑[2-3]。微小RNA（miRNA）可通过与mRNA 3'-UTR中互补位点相互作用来负向调控mRNA的表达，大量研究[4]已表明，miRNA在哮喘等气道炎症疾病中具有重要作用。研究[5]表明miR-339可通过靶向抑制FGF信号传导途径从而抑制肺动脉平滑肌细胞（PASMC）的增殖，但miR-339是否同样影响气道平滑肌细胞的增殖还未可知。在大肠癌中，miR-339-5p可通过抑制p-ERK1/2表达发挥抑制癌细胞生长的作用[6]，但其在ASMCs是否能调控ERK1/2通路还未见报道。因此本研究探究了其对气道平滑肌细胞增殖及ERK1/2通路的影响，以期为研究抑制ASMCs细胞增殖的作用机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂

BCA蛋白检测试剂盒、MTT检测试剂盒、HRP标记的山羊抗兔IgG二抗抗体、PD98059（货号：K12862、BTN111105、WE0381-QAN、M00029-XJT）购自北京百奥莱博科技有限公司；FITC标记的羊抗兔IgG（货号：0295G-FITC）购自上海雅吉生物科技有限公司；兔抗β-actin、Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2)、p44/42 MAPK (Erk1/2)、Caspase-3、Bax（货号：4970、9101、9102、9661、2772）购自Cell Signaling Technology；兔抗增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA）、Bcl-2（货号：10205-2-AP、12789-1-AP）购自是Proteintech；兔抗c-Myc、CyclinD1抗体（货号：ab32072、ab16663） 购 自 abcam；Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection试剂盒（货号：A211-01/02）购自南京诺唯赞生物公司。

1.2 实验动物

BALB/c雌性小鼠购自华中科技大学动物实验中心，许可证：SCXK（鄂）2016-0009，全部实验大鼠于室温为23 ℃的室内，正常昼夜节律适应性饲养7 d，期间自由饮水采食。

1.3 实验方法

1.3.1 ASMCs细胞增分离、培养 在无菌环境下戊巴比妥钠腹腔注射处死小鼠取其支气管组织，PBS清洗并剪为1 mm 3小块，胰蛋白酶（0.25%）消化，100目滤网过滤后10 min、1 000 r·min-1离心，加入DMEM培养调整细胞浓度为2×106个/mL，移入培养瓶于37 ℃、5%CO2培养箱中，2～3天更换一次培养基传代培养至第6代。

1.3.2 ASMCs细胞鉴定 将所得第6代细胞以5×104个/mL接种于24孔板内于37℃、5%CO2环境下培养24 h后进行免疫荧光实验：将已经过多聚甲醛（4%）固定的细胞用胎牛血清封闭2 h，α-actin抗体孵育24 h（1:100，4℃）后添加FITC标记羊抗兔IgG（1:200、1 h），DAPI溶液5 min孵育后PBS冲洗3次，干燥后中性树脂封片，于荧光显微镜观察。

1.3.3 ASMCs细胞转染 接种第6代ASMCs细胞到6孔板中（1×106个/孔，n= 5），设置为对照 组、 模 型 组（5 µg·L-1TGF-β1）、miR-NC 组（miR-NC+5 µg·L-1TGF-β1）、miR-339 mimics 组（miR-339 mimics+5 µg·L-1TGF-β1）、miR-339 mimics+PD98059 组（miR-339 mimics+10 µmol·L-1PD98059+5 µg·L-1TGF-β1），转染并进行相应处理，48 h后进行后续实验。

1.3.4 qRT-PCR检测miR-339表达 TRIzol试剂提取细胞总RNA，经纯度及浓度检测后反转录成cDNA，再行qRT-PCR检测miR-339表达量（内参：GAPDH），2-ΔΔCt分析 miR-339 表达水平（n= 5）。见表1。

表1 qRT-PCR引物

1.3.5 MTT法检测ASMCs活力 将各组ASMCs细胞在96孔板中（1×104个/孔）培养至对数生长期，添加5 g·L-1MTT （10 μL/孔）4 h后，加入DMSO（100 μL）震荡至结晶溶解，570 nm处测定吸光度OD值，计算ASMCs细胞存活率（%）=（OD处理组/OD对照组）×100%。

1.3.6 流式细胞术检测ASMCs凋亡率 将各组 ASMCs细胞调整为1×106个 /mL，与10μL Annexin V-FITC及PI避光孵育（15 min）后流式仪检测ASMCs细胞凋亡率（n= 5）。

1.3.7 Western blot检测ASMCs细胞内蛋白表达情况 RIPA裂解液裂解ASMCs细胞提取总蛋白，经定量、SDS-PAGE电泳、低温转至PVDF膜上后封闭，加 入 兔 抗 β-actin、p-ERK1/2、ERK1/2、PCNA、Bcl-2、c-Myc、Caspase-3、CyclinD1、Bax 一抗孵育过夜（4℃），次日孵育二抗2 h，蛋白凝胶成像仪定 量 p-ERK1/2、ERK1/2、PCNA、Bcl-2、c-Myc、Caspase-3、CyclinD1、Bax蛋白含量（n= 5）。

1.4 统计学方法

SPSS 23.0软件分析数据，采用均数±标准差（±s）描述计量资料，采用t检验进行2组间比较，采用单因素方差分析进行多组间比较，进一步比较采用SNK-q检验，P＜0.05指有统计学差异。

2 结果

2.1 ASMCs细胞形态鉴定

1）倒置显微镜下原代ASMCs细胞圆形胞核位于细胞中央，整体为梭形或长条形，融合后呈“峰和谷”状态；2）α-actin免疫荧光染色结果显示细胞呈绿色荧光染色，95%为α-actin阳性染色时可鉴定所培养细胞为ASMCs细胞。见图1、图2。

图1 原代ASMCs细胞形态学观察（×200）

图2 α-actin免疫荧光染色（×200）

2.2 转染效率检测

miR-339表达水平见表2；荧光显微镜观察ASMCs细胞转染效果见图2。

表2 miR-339表达水平（±s，n= 5）

表2 miR-339表达水平（±s，n= 5）

注：与对照组比较，#P＜0.05

组别 miR-339对照组 1.00±0.02 miR-NC组 0.99±0.07 miR-339 mimics组 1.59±0.17#

2.3 各组ASMCs细胞增殖情况检测

见图3、表3。

图3 ASMCs细胞增殖相关蛋白表达情况

表3 ASMCs细胞增殖情况检测（±s，n= 5）

表3 ASMCs细胞增殖情况检测（±s，n= 5）

注：与对照组比较，#P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与miR-339 mimics组比较，▲P＜0.05

组别 细胞存活率 /% c-Myc/β-actin CyclinD1/β-actin PCNA/β-actin对照组 100.00±00.00 0.91±0.15 1.01±0.11 1.08±0.12模型组 151.13±15.46# 1.66±0.10# 1.71±0.13# 1.74±0.11#miR-NC 组 154.15±16.75 1.64±0.11 1.70±0.14 1.76±0.14 miR-339mimics组 136.82±14.11△ 1.33±0.10△ 1.57±0.10△ 1.48±0.13△miR-339 mimics+PD98059组 123.74±15.98▲ 1.10±0.18▲ 1.28±0.10▲ 1.21±0.10▲

2.4 各组ASMCs细胞凋亡情况检测

见表4、图4、图5。

表4 各组ASMCs细胞凋亡情况检测结果（±s，n= 5）

表4 各组ASMCs细胞凋亡情况检测结果（±s，n= 5）

注：与对照组比较，#P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与miR-339 mimics组比较，▲P＜0.05

组别 凋亡率 /% Caspase-3/β-actin Bax/β-actin Bcl-2/β-actin对照组 25.03±2.19 1.59±0.10 1.55±0.11 0.56±0.20模型组 7.46±1.19# 0.51±0.10# 0.63±0.11# 1.12±0.19#miR-NC 组 7.06±0.10 0.50±0.11 0.59±0.08 1.13±0.21 miR-339 mimics组 12.16±1.91△ 1.11±0.20△ 1.03±0.18△ 0.92±0.17△miR-339 mimics+PD98059组 18.27±2.34▲ 1.35±0.25▲ 1.45±0.21▲ 0.60±0.08▲

图4 各组ASMCs细胞凋亡情况

图5 各组ASMCs细胞凋亡相关蛋白表达情况

2.5 各组ASMCs细胞内通路相关蛋白表达情况

见表5、图6。

表5 各组ASMCs细胞内通路相关蛋白表达情况（±s，n = 5）

注：与对照组比较，#P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与miR-339 mimics组比较，▲P＜0.05

组别 p-ERK1/2 / ERK1/2对照组 0.71±0.20模型组 1.72±0.13#miR-NC组 1.74±0.17 miR-339 mimics组 0.95±0.14△miR-339 mimics+PD98059组 0.63±0.10▲

图6 ASMCs细胞内通路相关蛋白表达情况

3 讨论

研究[7-8]发现在哮喘小鼠中，TGF-β1能通过上调miR-181a表达来抑制抑癌基因PTEN诱导的ASMCs细胞增殖。近几年，关于miR-339在肺动脉平滑肌细胞的研究发现，其能够通过靶向抑制胰岛素样生长因子2-mRNA结合蛋白1（insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 1，IGF2BP1）、FGF信号传导途径、及p38 MAPK信号通路来抑制PASMC细胞增殖[5，9]。还有研究[10]发现，INK4基因座（ANRIL）通过抑制miR-399-5p表达促进人主动脉血管平滑肌细胞（HA-VSMC）增殖和迁移。PCNA与细胞增殖密切相关并已被作为细胞增殖标志物，其主要表达于细胞增殖期[11]。本研究发现，与对照组相比，模型组ASMCs细胞存活率、c-Myc、CyclinD1、PCNA、Bcl-2表达水平显著增加；与模型组相比，miR-339 mimics组ASMCs细胞存活率、c-Myc、CyclinD1、PCNA、Bcl-2表达水平显著降低，而Bax、Caspase-3表达、细胞凋亡率显著增加。该结果表明miR-339过表达能显著抑制ASMCs细胞增殖，促进其凋亡，其有作为哮喘等阻塞性肺疾病潜在治疗靶标的潜能。

ERK1/2信号通路是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成员之一，其激活能够将膜表面受体传至细胞核，并且被各种生长因子所调节[12-13]。研究发现，ERK1/2在ASMCs细胞中分布广泛，其参与细胞的增殖和气道重塑，其磷酸化水平增加可能导致人气道平滑肌（HASM）细胞增长且数量增加[2-3，14]。有报道称ATP竞争性和功能选择性ERK1/2抑制剂能有效抑制ASM细胞中血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）介导的细胞增殖、IL-6分泌和胶原蛋白的生成[15]。还有研究[6]表明，miR-339-5p可通过抑制p-ERK1/2表达发挥抑癌大肠癌细胞生长的作用。本研究发现，与miR-339 mimics组相比，miR-339 mimics+ PD98059组ASMCs细胞存活率、c-Myc、CyclinD1、PCNA、Bcl-2、p-ERK1/2 / ERK1/2表达水平显著降低，而Bax、Caspase-3表达、细胞凋亡率显著增加。该结果表明miR-339对ASMCs细胞增殖和凋亡的影响可能与ERK1/2信号通路有关。