杨宝莲，吴建华，廖洲青

（江西省赣州市中医院制剂室，赣州 341000）

新甲伤药胶囊源于赣州市中医院院长、骨伤科主任连育才副主任中医师及其团队的经验方“伤科中药散”，因其在治疗跌打损伤、瘀血肿痛、伤筋动骨等方面疗效显著，确定为医院协定处方。

此方是由三七、红花、当归、醋乳香、醋没药、仙茅、煅自然铜、肉桂等中药材组成的复方制剂，在之前的临床使用过程中，均是以原药材研粉后直接吞服，难以对其质量进行有效控制，且在使用保管上极为不便。

本研究旨在中医理论和现代药学质量源于设计（Qualityby Design，QbD）理念的指导下，对该自拟粉剂，开展生产工艺的研究并制订质量标准，采用HPLC法对处方中的主要活性成分三七建立质量控制方法，以确保该制剂在临床应用中的质量稳定性。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药 仪器：Agilent1200高效液相色谱仪（四元泵，紫外检测器）、Agilent Chemistation化学工作 站、Mettler toledo电子分析天平、Kq3200de超声清洗仪。对照品：人参皂苷Rb1（批号：110704-202028）、人参皂苷Rg1（批号：110703-202034）、三七皂苷R1（批号：110745-201921），以上对照品来源于中国食品药品检定研究院。样品：新甲伤药胶囊（自制，批号20200603）。试剂：乙腈为色谱纯、水为超纯水，其余试剂为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱：安捷伦C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长：203 nm；柱温：30℃；进样量：10 μL；外标法。

表1 色谱梯度洗脱

1.2.2 对照品溶液的制备 取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Rb1对照品、三七皂苷R1对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含人参皂苷Rg10.2 mg、人参皂苷Rb10.2 mg、三七皂苷R1 0.05 mg的混合溶液，摇匀，即得。

1.2.3 供试品溶液的制备 取装量差异项下的本品内容物，研细，取2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水饱和的正丁醇50 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率360 W，频率40 kHz）20分钟，放冷，再称定重量，用水饱和的正丁醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL，加氨试液洗涤2次（15 mL，10 mL），取正丁醇液，回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，并转移至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.2.4 缺三七阴性溶液的制备 取缺三七阴性样品，照供试品溶液的制备方法同法制成缺三七的阴性溶液。

2 结果

2.1 系统适应性试验 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、缺三七阴性溶液各10 μL注入液相色谱仪，用流动相进行梯度洗脱，记录色谱图，结果见图1～图6。

图1 人参皂苷Rg1对照品溶液HPLC色谱图

图2 人参皂苷Rb1对照品溶液HPLC色谱图

图3 三七皂苷R1对照品溶液HPLC色谱图

图4 混合对照品溶液HPLC色谱图

图5 供试品溶液HPLC色谱图

结果：由图可见，人参皂苷Rg1保留时间约30分钟，人参皂苷Rb1保留时间约57分钟，三七皂苷R1保留时间约27分钟，与其它各峰达到基线分离，缺三七阴性无干扰，理论塔板数按三七皂苷R1峰计算在4000以上，符合标准规定。

2.2 线性关系考察 精密吸取混合对照品（含三七皂苷R10.300 mg/mL、人参皂苷Rg10.753 mg/mL、人参皂苷Rb10.755 mg/mL）2 mL、3 mL、5 mL、10 mL、20 mL至25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成浓度分别为三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂 苷Rb1（0.0240 mg/mL、0.0602 mg/mL、0.0604 mg/mL；0.0360 mg/mL、0.0904 mg/mL、0.0906 mg/mL；0.0600 mg/mL、0.1506 mg/mL、0.1510 mg/mL；0.1200 mg/mL、0.3012 mg/mL、0.3020 mg/mL；0.2400 mg/mL、0.6024 mg/mL、0.6040 mg/mL）的5个浓度的混合对照品溶液，分别精密吸取10 μL，注入液相色谱仪中，记录色谱图，按拟定色谱条件测定，以对照品的浓度（mg/mL）为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。得三七皂苷R1回归方程Y=1880.9X-2.5488，R2=0.9993；人参皂苷Rg1回归方程Y=2618.6X-19.423，R2=0.9991；人参皂苷Rb1回归方程Y=2098.5X-27.182，R2=0.9993。见表2和图7~图9。

表2 线性关系考察结果

图7 三七皂苷R1线性关系图

图8 人参皂苷Rg1线性关系图

图9 人参皂苷Rb1线性关系图

结果：三七皂苷R1进样浓度在0.0240 mg/mL～0.2400 mg/mL，人 参 皂 苷Rg1进 样 浓 度 在0.0602 mg/mL～0.6024 mg/mL，人参皂苷Rb1浓度在0.0604 mg/mL～0.6040 mg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.3 精密度试验 取混合对照品溶液，连续进样6次，测定峰面积，见表3。结果RSD均小于2%，精密度良好。

表3 精密度试验结果

2.4 重复性试验 取同一批号的样品 （批号：20200603），按上述供试品溶液制备方法，平行制备供试品溶液共6份，依法测定，计算含量，见表4。结果RSD均小于2%，重复性良好。

表4 重复性试验测定结果

2.5 稳定性试验 取供试品溶液，按样品测定项下的色谱条件，分别在0、2、4、8、12、18、24小时后进样测定，见表5。结果RSD均小于2%，供试品溶液在24小时内稳定性良好。

表5 稳定性试验结果

2.6 加样回收率试验 取已知含量的新甲伤药胶囊（批号：20200603，每1g含三七皂苷R11.32 mg、人参皂苷Rg13.97 mg、人参皂苷Rb12.59 mg）6份，各1 g，精密称定，分别精密加入对照品适量，按供试品溶液的制备方法制备加样回收样品溶液，依法测定，计算回收率，见表6~表8。结果RSD均小于2%，回收率良好。

表6 三七皂苷R1加样回收试验结果

表7 人参皂苷Rg1加样回收试验结果

表8 人参皂苷Rb1加样回收试验结果

2.7 耐用性试验 取批号20200603样品进行耐用性试验，分别在不同流速、不同柱温、不同色谱柱条件下测定人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1的总含量，见表9~11。结果表明，在不同流速、柱温和色谱柱条件下样品的含量测定结果无显著性差异，RSD均小于2%，耐用性好。

表9 耐用性流速试验

表10 耐用性柱温试验

表11 耐用性色谱柱试验

2.8 样品含量测定 取三批新甲伤药胶囊中试样品，按正文所述的方法测定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的总量，见表12。

表12 样品含量测定结果

2.9 样品含量限度的确定 中试样品所用三七中人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1的总量为5.91%，水分为7.0%，三批中试样品人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1的总量的转移率分别为95.95%、96.36%、95.55%，平均转移率为95.95%。《中国药典》[1]2020年版一部收载三七，规定饮片水分不得过14.0%，含量按干燥品计算，含人 参 皂 苷Rg1（C42H72O14）、人 参 皂 苷Rb1（C54H92O23）及三七皂苷R1（C47H80O18）的总量不得少于5.0%。本品每粒胶囊含三七0.043 g，按90%转移率计算，每粒胶囊中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1及三七皂苷R1的总量为1.664 mg。故拟确定本品中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1及三七皂苷R1的含量限度为：本品每粒含三七以人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1及三七皂苷R1的总量计，不得少于1.7 mg。三批中试样品均符合规定。

2.10 结论 通过方法学各项指标考察，均符合中药指导原则的要求，说明该方法可操作性强、专属性好、准确度及精密度高且稳定性可靠，可以作为本品中三七含量测定方法。

3 讨论

3.1 检测指标的选择 新甲伤药胶囊为三七、红花等十六味制成的中药复方制剂，总方活血化瘀、消肿止痛、接骨生肌，用于跌打损伤、瘀血肿痛、伤筋动骨、扭伤等。三七具有散瘀止血、消肿定痛的功效，为本方君药，人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1及三七皂苷R1为三七有效成分[2]，故拟将人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1及三七皂苷R1作为本品的含量指标，并采用HPLC法测定其总量[3-6]。

3.2 提取溶液的选择 在测定皂苷类成分含量时，我们先后采用了甲醇、50%甲醇、70%甲醇、水饱和的正丁醇等数种提取液，结果显示，除本文所述方法外，其它试液萃取过程繁琐、主成分提取量少而杂质成分多，样品也不易蒸干，最终造成误差大难以控制。而本文所采用的方法简便易行、提取效率高，实际检测中，色谱峰也能达到很好的分离。

3.3 检测波长的选择 人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1及三七皂苷R1的化学结构接近，其理化性质也基本相似，故有相似的色谱响应。紫外扫描发现，三者在200~210 nm之间有较大的吸收峰，尤其在203 nm处其响应值最为明显，参照相关文献，最终确定203 nm为本实验检测波长。