尚娇娇，胡 玲，方 健，叶守东，孙 敏

(安徽大学 生命科学学院，安徽 合肥 230601)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，简称DN)是糖尿病患者的常见微血管并发症之一，其主要病理变化为细胞外基质增加、肾小球肥大，肾小球和肾小管基底膜增厚等，最终导致肾小球硬化伴有肾间质纤维化[1].Ras-related C3肉毒毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，简称Rac1)是Rho家族小GTPases的一员，被证明参与DN肾小球系膜细胞外基质(extracelluar matrix，简称ECM)聚集[2]，高血糖、糖基化终末产物(advanced glycated end products，简称AGEs)、血管紧张素II(Angiotensin II，简称ANG II)、生长因子等水平升高都能引起Rac1过度激活[3-5].Janus激酶/信号转导子和转录激活子(Janus kinase/Signal transducer and activator of transcription，简称JAK/STAT)通路是一条由细胞因子激活的信号通路，在DN中被激活，从而产生转化生长因子[6].转化生长因子β(transforming growth factor-β，简称TGF-β)是一种多功能细胞因子，与增殖、凋亡、分化和纤维化有关，TGF-β作为肾小球硬化进展的中心介质，导致肾脏中异常ECM蛋白的积累和平滑肌α-肌动蛋白的不恰当表达[7-9].由于Rac1和JAK/STAT信号均涉及ECM的形成，因此，Rac1与JAK/STAT信号通路的关系，及在系膜细胞损伤中的作用有待于深入研究，笔者通过构建持续激活型Rac1(G12V)肾小球系膜细胞，研究Rac1激活对JAK/STAT信号通路的影响，及在系膜细胞损伤中的作用.

1 材 料

1.1 试 剂

PiggyBac(PB-FLAG)转座子质粒载体由安徽大学生命科学学院叶守东老师实验室提供；Trizol，Transgene公司；逆转录试剂盒，白鲨生物公司；PCR反应体系，南京诺维赞公司；限制性内切酶BgI II，Xho I，NEB公司；T4 DNA连接酶、DH5α大肠杆菌，TaKaRa公司；DNA凝胶回收试剂盒，杭州倍沃医学科技公司；DNA纯化回收试剂盒，北京天根公司；琼脂糖、DCFH-DA，美国Sigma公司；LB培养基，上海生工公司；引物设计，NCBI数据库；引物合成和测序，安徽通用公司；DNA-Hieff TransTM脂质体核酸转染试和嘌呤霉素，上海翌圣公司；小鼠肾小球系膜细胞株(mouse mesangial cell, 简称MES)，中国科学院典型培养物集存库；DMEM，北京索莱宝公司；FBS，杭州四季青公司；NADPH氧化酶活性试剂盒，北京百奥莱博公司；小鼠TGF-β Elisa试剂盒，武汉亚科因公司；FLAG抗体、JAK2抗体、FN抗体、GAPDH抗体，武汉Proteintech公司；p-JAK2抗体，武汉ABclonal公司；STAT3抗体、p-STAT3抗体，美国Cell Signaling Technology公司；HRP二抗，上海萨博公司；羊抗兔FITC荧光二抗，武汉博士德生物公司；硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，简称NC膜)，美国GE公司；ECL显影液，上海天能科技有限公司.

1.2 仪 器

PCR仪、NanoDrop超微量分光光度计，美国赛默飞公司；琼脂糖水平电泳仪，北京六一公司；超净工作台，新加坡ESCO；二氧化碳培养箱，日本松下公司；倒置显微镜，日本奥林巴斯公司；多功能酶标仪，美国BioTek公司；JS-1070P型化学发光成像系统，上海培清科技有限公司；DYY-4C型电转膜仪及电泳仪装置，上海天能科技有限公司；徕卡TCS SP8 MP多光子共聚焦显微镜，德国徕卡公司.

2 方 法

2.1 Rac1过表达突变体转移载体质粒的构建

Trizol法抽提系膜细胞全基因组，逆转录为cDNA，由Rac1序列合成引物

GAAGATCTATGCAGGCCATCAAGTGTGTGGTG(上游引物)，

CCGCTCGAGTTACAACAGCAGGCATTTTCTCTTC(下游引物)

扩增Rac1目的基因，再以Rac1目的基因为模板，用上游引物

GAAGATCTATGCAGGCCATCAAGTGTGTGGTG，

下游引物

GAAGATCTATGCAGGCCATCAAGTGTGTGGTGGTGGGAGACGTAGCTGTTGGT

扩增出含有上游酶切位点Bgl II及下游酶切位点Xho I的突变体Rac1(G12V)目的基因.将突变体Rac1(G12V)目的基因及带有FLAG标记的PiggyBac(PB-FLAG)转座子质粒载体用限制性内切酶Bgl II和Xho I双酶切，再经胶回收试剂盒回收大小片段，连接酶试剂盒连接大小片段，构建突变重组载体PB-Rac1(G12V).重组质粒转化入DH5α感受态细胞，筛选重组质粒的阳性克隆，扩增后抽提质粒，双酶切PCR鉴定及质粒测序鉴定.

2.2 转染MES细胞

将含10% FBS的DMEM培养基培养的MES细胞，以3×105mL-1密度接种于6孔板中，放置于37 ℃，5% CO2细胞培养箱中培养，待细胞达到60%汇合时开始转染.设置空白对照组、PB空载组、PB-Rac1(G12V)组.DNA-Hieff TransTM脂质体核酸转染试剂复合物的配置：先取250 μL DMEM稀释质粒DNA并混匀；再取250 μL DMEM稀释脂质体核酸转染试剂，室温孵育3 min；再将稀释好的DNA和稀释的脂质体核酸转染试剂轻轻混匀成共500 μL的混合液，并在室温下避光孵育20 min；最后，再加入700 μL的无血清DMEM，使其成为总体积1 200 μL的转染试剂复合物.弃掉MES细胞的培养液，加入转染试剂复合物进行转染，6 h后弃去培养基每孔加入2 mL新鲜的培养基.转染48 h后更换为含终浓度2 μg·mL-1嘌呤霉素的DMEM完全培养基进行筛选.筛选完成后收集细胞样品，Western blot法对细胞进行FLAG标记验证.

2.3 活性氧(reactive oxygen species，简称ROS)及NADPH氧化酶活性测定

正常MES细胞、Rac1(G12V)组MES细胞用DMEM完全培养基混悬后，以3×104mL-1密度分别接种于96孔板和24孔板，每组设置3个复孔，分别用于检测ROS、NADPH氧化酶.将细胞培养于37 ℃，5% CO2培养箱中，48 h后弃去96孔板培养基，预冷PBS清洗2遍，每孔加10 μmol·L-1DCFH-DA 100 μL，37 ℃避光孵育30 min，PBS洗3遍，酶标仪激发光485 nm，发射光530 nm检测荧光值.

48 h后弃去24孔板培养基，按照NADPH氧化酶试剂盒说明书检测NADPH氧化酶活性.

2.4 Elisa检测TGF-β水平

正常MES细胞、Rac1(G12V)组MES细胞以3×104mL-1密度接种于24孔板，每孔1 mL，每组设置3个复孔.48 h后收集正常组、Rac1过表达突变组的MES细胞上清于4 ℃，12 000 r·min-1离心5 min，取上清,按照试剂盒说明书检测TGF-β的表达含量.

2.5 Western blot检测

正常组、Rac1(G12V)组MES细胞以3×105mL-1密度接种于T25细胞瓶中，48 h后收集细胞于离心管中，离心弃上清，每管加入适量预冷的RIPA裂解液，超声裂解2次，冰上静置1 h后，于4 ℃，12 000 r·min-1离心20 min.离心结束后取上清进行BCA蛋白定量测定，调蛋白浓度一致后加入上样缓冲液混匀并在沸水浴中煮5 min，制成的样品于-20 ℃冰箱保存.样品进行SDS-PAGE电泳、转膜、封闭,一抗4 ℃孵育过夜,二抗室温孵育2 h，TBST清洗后ECL曝光，并使用ImageJ进行灰度值分析.

2.6 免疫荧光

正常MES细胞、Rac1(G12V)组MES细胞以3×104mL-1密度接种于激光共聚焦专用细胞培养皿中，每孔2 mL，48 h后取出培养皿，弃上清，预冷PBS 清洗2遍，冰乙醇室温固定20 min，PBS洗3遍，加入5% BSA 37 ℃封闭1 h，弃BSA，一抗4 ℃孵育过夜，PBS洗3遍，加入FITC标记二抗，37 ℃避光孵育1 h，DAPI孵育15 min，PBS洗3遍.每个培养皿中加入1 mL PBS覆盖细胞，置于徕卡TCS SP8 MP多光子共聚焦显微镜下观察并拍照.

2.7 统计学分析

3 结 果

3.1 成功构建Rac1(G12V)持续磷酸化突变体并在MES细胞中表达

该实验构建了Rac1点突变体(G12V)，图1(a)表示PB-Rac1(G12V)质粒中Rac1(G12V)的琼脂糖电泳图，图中Rac1(G12V)的条带在正确位置，重组构建成功.序列比对结果显示，全自动测序的结果中，Rac1(G12V)与GeneBank中Rac1序列仅在CDS区第35位碱基处存在差异(A-T)，其余序列完全一致.证明所构建的Rac1持续磷酸化突变体G12V序列均完全正确.转染成功后收集细胞，制备样品以抗FLAG的抗体进行免疫印迹检测Rac1突变体的蛋白表达,结果显示(图1(b)～(c))，Rac1突变体在转染的MES细胞中得到很好的表达，细胞形态正常.因此，笔者成功构建的Rac1持续磷酸化突变体可用于Rac1功能调节的进一步研究.

(a)Rac1(G12V)的琼脂糖电泳图；(b)转染的MES细胞中Rac1突变体蛋白表达的免疫印迹检测；(c)～(d)转染的MES细胞.

3.2 Rac1(G12V)对MES中NADPH氧化酶和活性氧ROS的影响

NADPH氧化酶是一种多亚基复合体，是细胞中产生ROS的主要来源，Rac1是其组成亚基之一.Rac1活化可导致NADPH氧化酶活性增加，因此观察Rac1持续激活对NADPH氧化酶活性和产生ROS的影响，结果如图2所示.

与对照组相比，

图2显示，Rac1(G12V)组的NADPH氧化酶活性明显高于对照组，其ROS的表达水平也明显高于对照组.提示Rac1活化导致NADPH氧化酶活性增加并产生大量ROS.

3.3 Rac1(G12V)对MES中JAK2/STAT3信号通路的作用

3.3.1 Rac1(G12V)激活JAK2/STAT3信号通路

JAK2/STAT3信号通路在DN状态下被各种因素，如高糖、AGE、氧化应激等激活，进一步探究Rac1激活对JA2/STAT3信号通路的影响，结果如图3所示.

(a)p-JAK2/JAK2的表达,(b)p-STAT3/STAT3的表达; 与对照组相比，

由图 3可知，Rac1(G12V)组p-JAK2/JAK2以及p-STAT3/STAT3的表达比对照组显著增加，提示Rac1能激活JAK2/STAT3信号通路.

3.3.2 Rac1(G12V)对MES产生TGF-β的作用

为进一步验证Rac1对JAK2/STAT3信号通路的激活作用，检测其下游信号分子TGF-β的表达，结果如图4所示.

与对照组相比，

图4显示，Rac1(G12V)组的TGF-β表达水平明显高于对照组，提示Rac1活化可以激活JAK2/STAT3信号通路.

3.3.3 Rac1(G12V)对MES纤连蛋白(FN)的影响

TGF-β被认为可以促进系膜细胞肥大，促使ECM 积聚，从而在DN肾小球硬化和肾间质纤维化中起着重要作用，而纤连蛋白(fibronectin，简称FN)是ECM的主要成分，因此通过检测FN水平来反应ECM积聚情况，结果如图5所示.

由图5可知，Rac1(G12V)组的FN表达水平明显高于对照组，免疫荧光实验显示Rac1(G12V)的FN表达增强，提示突变过表达的Rac1能增加系膜细胞ECM的积聚.

4 讨 论

Rho(小G蛋白)是Ras蛋白超家族的一个亚群，具有GTP酶活性，又称为Rho GTP酶(GTPase)，在该家族中，Rac1是研究最广泛的成员之一，于1989年被发现为Ras相关的C3肉毒毒素底物1，分子量为21 kDa，由192个氨基酸编码组成[10].随后，它被证明在多种细胞中发挥基本作用，包括肌动蛋白细胞骨架重组、细胞转化、诱导DNA合成、超氧化物产生和细胞迁移[11].Rac和Rho GTPase是GTP结合蛋白，起分子开关的作用.当与GTP结合时，GTPase可以与效应分子或靶标分子相互作用并启动信号转导，当它们与GDP结合在一起时，这种信号传导就被抑制[12].Rac1的异常表达或激活可引起异常的细胞信号传导，从而导致病理损伤，Rac1蛋白作为NADPH氧化酶的一个活性亚基，其活性变化将会直接影响其所依赖的Rac1/NADPH 信号通路的激活和抑制，而来源于NADPH氧化酶的ROS被认为是糖尿病及其并发症发病的始作俑者[13].此外，GTPases的Rac/Rho家族是肌动蛋白细胞骨架的关键调控因子[14]，在DN肾纤维化中形成的作用已被证实，Hubchak等[15]认为Rac1通过一种不直接改变经典Smad3信号事件的机制来增强TGF-β1诱导的I型胶原表达.

JAK/STAT信号通路是一条具有信号转导和基因转录双重功能的信号通路，可介导炎症、细胞增殖和纤维化信号的传递[16].在DN中，JAK2/STAT3信号通路被高血糖、氧化应激、AGE等激活，引起TGF-β过表达，导致ECM扩张、肾小球基底膜以及纤连蛋白FN、层粘连蛋白和I胶原蛋白的积累，最终加速DN的发生和发展[17].此外，研究表明Rac1突变体显著提高了JAK2的活性，突变激活的Rac1增加JAKs的磷酸化和STATs的转录活性[18].Rac1可以通过激活 IL-6/JAK2通路或直接与STAT3结合来激活STAT3和信号转导[19].

为了研究Rac1激活在系膜细胞损伤中的作用，笔者构建了持续激活的Rac1(G12V)重组载体，导入MES细胞后稳定表达.G蛋白偶联受体不仅能在激动剂刺激后传递信号，还能自发偶联到信号转导通路，即在没有激动剂存在的情况下本身可以转变成活性构象，传递信号[20].笔者所设计的 Rac1 组成型激活突变体 Rac1(G12V)是对照 Rac1的组成型突变体将P-loop上12位的G/甘氨酸突变为V/缬氨酸，能够模拟野生型G蛋白的激活状态，人为构建组成型激活突变体[21].研究结果表明，由持续性Rac1激活可激活JAK2/STAT3信号通路，使TGF-β过度表达及细胞外基质积累.但是Rac1激活是通过ROS还是直接激活STAT3有待于进一步研究证实.