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微生物来源的果胶相关裂解酶的研究进展

2023-01-16徐寅啸宁利敏朱本伟

生物加工过程 2022年6期
关键词:醛酸果胶酶残基

郑 玲,李 谦,徐寅啸,宁利敏,朱本伟,姚 忠

(1. 南京工业大学 食品与轻工学院,江苏 南京 211800;2. 南京中医药大学 医学院·整合医学院,江苏 南京 210023)

果胶(pectin)是一种带负电荷的酸性杂多糖,主要存在于高等植物细胞壁中[1-2],当它与植物组织中的纤维素、木质素等相互交联时,可赋予细胞壁刚性,成为阻碍病原微生物入侵的天然屏障。因此,对于植物病原体来说,自然界中存在的大量细胞壁降解酶(包括果胶酶、纤维素酶和蛋白酶等)使其能够突破植物细胞壁屏障进入宿主细胞,其中,果胶酶(pectinase)是能够催化果胶物质分解的一类酶的总称[3-4]。目前,果胶酶已经成为最重要的生物催化剂之一,广泛应用于果汁提取、动物饲料生产、棉纤维的纺织加工、植物韧皮纤维的脱胶和废水处理等领域[5-6]。

在果胶酶中,果胶裂解酶(pectin lyase,EC 4.2.2.10)和果胶酸裂解酶(pectate lyase,EC 4.2.2.2)都能通过β-消除机制裂解果胶或果胶酸分子骨架的α-1,4-糖苷键,从而生成不饱和的果胶寡糖,并且不会产生高毒性的甲醇,这引起了人们极大的兴趣[7-8]。果胶裂解酶和果胶酸裂解酶又分别称多聚甲基半乳糖醛酸裂解酶(PMGL)和多聚半乳糖醛酸裂解酶(PGL)。根据CAZy数据库,它们分属于不同的多糖裂解酶(PLs)家族,其中已经得到表征的果胶酸裂解酶(PGL)主要来源于PL1、PL2、PL3、PL9和PL10家族,而已知的果胶裂解酶(PMGL)目前仅集中在PL1家族。从结构上来看,来自PL1、PL3和PL9家族的裂解酶采用平行的β-螺旋结构,而来自PL2的PGLs采用(α/α)7桶状结构,来自PL10家族的PGLs则呈现(α/α)3桶状结构。

迄今为止,已经有大量果胶酶相关的研究得以发表[5,9-12],本文将从这些裂解酶的来源、分类、序列分析、作用模式、三维结构及催化机制等方面进行综述,以利于加深人们对果胶相关裂解酶的系统认知。此外,由于果胶是这些裂解酶的主要底物,因此简要探讨其结构和组成等特征。

1 果胶结构和特性

美国化学协会(ACS)将果胶类物质分为原果胶、果胶酸、果胶酯酸和果胶4种主要类型[7],其中,果胶是一种结构复杂的大分子多糖,广泛存在于柑橘、柠檬、苹果和南瓜等高等植物的细胞壁中[2,13]。来源不同的果胶酯化度也不同,以酯化度(degree of esterification,DE)50%为界限,可将果胶分为高甲氧基果胶(high methoxyl pectin,DE>50%)和低甲氧基果胶(low methoxyl pectin,DE<50%)[14]。工业上,柑橘、苹果和柚果等的果皮和废渣是果汁生产的副产物,也是生产果胶的重要原材料之一。

果胶是一种酸性杂多糖,通过α-1,4糖苷键连接D-半乳糖醛酸形成多糖主链,侧链则由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖和木糖等单元构成[11],其中,聚半乳糖醛酸的羧基部分被甲基酯化,未甲酯化的羧基以游离形式存在或被K+、Na+和NH4+部分或完全中和。一般来说,天然的果胶分子并非呈线形,而是具有多分支的结构,可大致分为均匀区(smooth region)和毛发区(hairy region)[15]。它主要由3种结构特征良好的多糖组分构成:同型半乳糖醛酸聚糖(homogalacturonan,HGA)、鼠李半乳糖醛酸聚糖I(rhamnogalacturonan Ⅰ,RG Ⅰ)、鼠李半乳糖醛酸聚糖Ⅱ(rhamnogalacturonan Ⅱ,RG Ⅱ)以及小部分的木糖半乳糖醛酸聚糖(xylogalacturonan,XGA)[3,16](图1)。

图1 果胶的结构[3,16]Fig.1 The structure of pectin[3,16]

商业果胶一般为白色至淡黄色粉末,而且不同来源的果胶成分存在较大差异,但其性质与甲酯化程度密切相关。果胶分子可溶于水形成黏稠的胶体溶液,但不溶于大多数有机溶剂。它在水中的溶解性与果胶分子的聚合度和酯化度有关。在酸、碱或果胶酶等存在下,果胶分子可发生酯水解或者糖苷键断裂,生成半乳糖醛酸或醇等物质。在适当条件下,果胶能够与糖、酸或者Ca2+形成凝胶[1]:在高糖浓度和低pH条件下,高甲氧基果胶可形成凝胶;而低甲氧基果胶在Ca2+存在的情况下,即使没有糖也可形成凝胶[13]。因此,果胶形成凝胶的能力在食品和制药工业中得到了广泛的应用,如作为增稠剂等[17]。具体来说,绝大部分的果胶被用于食品行业,如凝胶软糖、果冻、乳制品和蜜饯等的生产,或是在食品加工时作为稳定剂、乳化剂等。除此之外,果胶也被用于医药、化妆品等行业,如生产防治糖尿病、肥胖症等的保健品。

2 果胶酶分类和来源

果胶酶是一类能够催化果胶物质转化的酶的总称,也是细菌、真菌和植物中分布最广泛的酶之一。复杂果胶的完全降解需要一组具有明显底物特异性的果胶酶的协同作用[5,18]。由于底物结构的多样性,果胶酶存在不同的分类标准,可将果胶酶大致分为果胶酯酶(pectin esterase)、果胶水解酶(pectin hydrolases)、原果胶酶(protopectinase)、果胶裂解酶和果胶酸裂解酶(表1)[3,11]。按照其作用的最适pH,可分为碱性果胶酶和酸性果胶酶,其中,果胶裂解酶(PMGL)和果胶酸裂解酶(PGL)都属于多糖裂解酶(polysaccharide lyases,PLs),它们能通过β-消除机制直接裂解果胶分子骨架的α-1,4糖苷键,而不产生高毒性的甲醇,这引起了人们的极大兴趣[3]。迄今为止,所研究的降解果胶分子的裂解酶大多数来自细菌、真菌等微生物(表2),在植物和动物中也有少量报道。如,Yadav等[4]对来自黄曲霉的碱性PMGL进行了纯化和表征,Dong等[10]从尖孢镰刀菌中分离、表达并比较了2种PGLs特性,Jenkins等[19]探究了来自菊欧氏杆菌的PGL(Pel9A)的晶体结构等。总之,来源各异的果胶酶往往扮演着不同的角色:致病菌来源的PGLs可以促进病原微生物的入侵,而大多数来自丝状真菌的PGLs与植物腐烂相关;植物来源的PGLs往往参与了植物生长发育过程中的细胞壁降解和修饰,动物来源的PGLs则具有与植物病原细菌和真菌相似的降解植物细胞壁的作用[2]。此外,由于微生物所处的环境不同,PGLs和PMGLs呈现多样化的特征,特别是最适pH与温度,具体参见生化特性部分。

表1 果胶酶的分类[3,11]

表2 果胶裂解酶和果胶酸裂解酶的部分来源

PMGL和PGL均属于PLs家族,但具有不同的底物特异性。PMGL可以直接降解高甲氧基果胶,无需依靠酯酶去除甲酯基团[3,35]。大多数PGL可降解聚半乳糖醛酸以及低甲氧基果胶,但是对高甲氧基果胶活性较差[36]。值得注意的是,与聚半乳糖醛酸酶和果胶酯酶催化的反应不同,PMGL和PGL在降解果胶的同时均不产生高毒性的甲醇,还能保护对果汁特定香味负责的酯基团,使其不被破坏。因此,它们被广泛应用于果汁提取、咖啡和茶叶发酵、植物油提取、红酒的色度和稳定性提高、动物饲料生产、棉纤维的纺织加工和生物处理、植物韧皮纤维的脱胶和废水处理等领域。

3 果胶相关裂解酶结构及特性

3.1 序列分析

目前,蛋白质序列、结构和功能间的对应关系尚不明确:序列一致性高的蛋白,其结构与功能高度相似;然而部分序列一致性较低的蛋白却也具有类似的结构和功能。值得注意的是:在保持蛋白质功能方面具有重要作用的残基往往是高度保守的,并且与结构相似的蛋白质进行多重序列比对分析,有助于确定具有重要功能的氨基酸残基和进化轨迹[37]。因此,本文对来源于相同PL家族的一些序列进行了比对分析(图2~6),并构建了一个系统发育树来分析5个不同PLs家族PMGL和PGL的进化历程(图7)。由此发现,同一PL亚家族,总的序列同源性一般大于50%,但是亚家族之间的序列同源性要低得多。有的蛋白虽然序列同源性不高,但具有相似的二级结构,如,来源于Erwiniachrysanfhem的PelC[38],来源于Erwiniachrysanfhemi的PelE[23]以及来源于Bacillussubtilis的Pel[39]都具有类似的β-螺旋结构,此外,通过序列比对还发现:不同PLs家族都存在一些保守的氨基酸残基,这些残基通过疏水作用和静电效应参与了底物结合过程。具体来看,PGLs的底物结合口袋富含带正电的氨基酸,从而有利于与带负电荷的果胶酸底物相结合;而PMGLs的结合裂隙以芳香族残基为主,往往需要保守位点处的精氨酸去辅助结合底物[32]。

图2 来自PL1家族的果胶酸裂解酶的序列分析Fig.2 Multiple sequences alignment of pectate lyase from PL1 family

来自PL1、3和9家族的PGLs和PMGLs均具有β-螺旋结构,其中,有大量PL1家族的PGLs被报道[26-27,40]。将PL1家族中得到表征的PGLs进行多序列比对,结果表明在PL1家族中几个关键位点是高度保守的。根据晶体结构得到解析的CAB12585.1(PDB:1BN8)[39]来看,Asp244和Asp248与初级钙的结合密切相关,而Lys268和Arg305与底物结合相关(图2)。PL3家族结构解析的PGLs间序列同源性较低(20%~65%)。将结构得到解析的BAA87892.1(PDB:1EE6)[41]与该家族的酶进行多序列比对可知,与Ca2+结合位点有关的3个残基:Asp90、Glu110和Asp84以及与催化相关的残基Lys134、Lys156和Arg159在PL3家族中都是高度保守的(图3)。PL9家族只有Pel9A(PDB:1RU4)的结构被解析,它的Ca2+结合位点为Asp209、Asp233和Asp237,催化位点为Lys273[19],这些残基在PL9家族中同样是高度保守的(图4)。

图3 来自PL3家族的果胶酸裂解酶的序列分析Fig.3 Multiple sequences alignment of pectate lyase from PL3 family

图4 来自PL9家族的果胶酸裂解酶的序列分析Fig.4 Multiple sequences alignment of pectate lyase from PL9 family

迄今为止,PL2家族仅3种PGLs的结构得到了解析,均为(α/α)7桶状结构。此外,还有6种PGLs和1种PMGL的生化特性得到表征。序列比对结果显示,PL2家族的PGLs具有高度的序列同源性(78%~99%),如,来源于Yersiniaenterocolitica的YePL2A(PDB:2V8I)的催化残基(Arg194和Arg295)、底物结合位点(Glu153、Lys155和Glu538)和金属结合位点(His132、His195和Glu153)[28],在PL2家族中高度保守(图5)。此外,虽然PL10家族PGLs的序列同源性较低(25%~37%),但它们都为(α/α)3桶状结构,其中,Pel10A的Ca2+结合位点Asp451、催化碱Arg524和维持催化中心基团结构完整性的Glu535,在PL10家族中都是保守的,它们很有可能起着类似于Pel10A中的作用(图6)。

图5 来自PL2家族的果胶酸裂解酶的序列分析Fig.5 Multiple sequences alignment of pectate lyase from PL2 family

3.2 生化特性及作用模式

目前所表征的PMGLs和PGLs主要来源于细菌和真菌等微生物[2],本文对来源于不同PLs家族的裂解酶进行了比较(表3),如,来自Yersiniaenterocolitica的YePL2A优先作用于聚半乳糖醛酸,而YePL2B优先作用于半乳糖醛酸三糖[28]。并且YePL2A和YePL2B都显示出PGLs常见的底物抑制特性:在达到最佳浓度后,随着底物浓度增加,产物却减少。

表3 不同PLs家族果胶酸裂解酶的生化特性

PGLs和PMGLs在不同条件(pH、温度等)下,其酶活有着明显的差异。目前,酸性和中性果胶酶主要为聚半乳糖醛酸酶和PMGLs,也有少部分PGLs的最适pH呈酸性;大多数碱性PGLs的最适pH为8.0~11.5[2],如,PGL(recPEL S6)在最适pH 10.0和60 ℃时显示出最高酶活[42]。此外,由于产生果胶酶的天然微生物来源不同,PGLs和PMGLs可在不同温度范围内发挥作用,从而大致分为嗜热酶(>60或70 ℃)、中温酶(40~70 ℃)和冷适应酶(<40 ℃)。

严格保守的残基以红色背景突出显示,保守取代的残基位于框内。结构得到解析的果胶酸裂解酶:CAB12585.1(PDB:1BN8)、CAL14085.1(PDB:2V8I)、BAA87892.1(PDB:1EE6)、ADM99100.1(PDB:1RU4)和ACE85516.1(PDB:1GXM)的二级结构组成(α-螺旋、β-折叠等)分别显示在比对序列的上方。序列比对图使用ESPript 3.0绘制,图中的裂解酶统一以GenBank登录号表示。预测高度保守的氨基酸:与金属结合相关的用★对应标出,涉及底物结合的用▲对应标出,与催化残基相关的用●对应标出图6 来自PL10家族的果胶酸裂解酶的序列分析Fig.6 Multiple sequences alignment of pectate lyase from PL10 family

图7 不同PLs家族的果胶裂解酶和果胶酸裂解酶的系统发育树Fig.7 Phylogenetic trees of PGLs and PMGLs from different PLs families

不同金属离子和化学试剂对PGLs和PMGLs具有显著不同的影响。如,大多数PGLs是依赖Ca2+的金属酶,需要在底物结合袋内形成金属离子结合位点,其最佳Ca2+浓度范围为0.5~1.0 mmol/L[2]。然而,有研究报道,部分PGL的最佳Ca2+浓度<0.5 mmol/L或>1.0 mmol/L。如,来自Aspergillusluchuensisvar.saitoi的PGL的最佳Ca2+浓度为0.3 mmol/L[5]。在2.5 mmol/L Ca2+的存在下,PpPel10a的相对酶活得到了显著提高[43]。此外,5 mmol/L的Mn2+、Mg2+和Cu2+对AsPelA的酶活有一定抑制作用;在0.5%表面活性剂(SDS、Triton X-100和Tween-20)存在下,AsPelA却能保留其原始活性90%以上[5]。然而,这些金属离子对ApPel产生显著不同的影响[36]:1 mmol/L或10 g/L的Mn2+、Cu2+、Mg2+和Tween 20可以激活ApPel1活性;而一价的Ag+和K+几乎不影响ApPel1活性。此外,143 mmol/L的β-巯基乙醇,能显著抑制ApPel1酶活。还有研究通过EDTA抑制活性后加入过渡金属,发现来自Yersiniaenterocolitica的YePL2B在Mn2+存在下有最高的酶活回收[28]。

多糖裂解酶的作用模式可以通过研究其产物分布来确定,如,外切作用的PGLs通常仅产生单体或二聚体,而内切作用的PGLs产生较大的低聚物。目前得到表征的PMGL仅通过内切作用来降解底物,而PGL则可以通过内切或者外切模式起作用[42]。通过不同作用模式,PGLs和PMGLs可以利用果胶底物生产出聚合度不同的单糖和寡糖,这有利于果胶分子在更多领域得到充分的应用,因此有必要对其作用模式进行更深入的研究。

已经有不少研究对PGLs和PMGLs的作用模式以及产物分布进行了分析。Abbott等[28]对来自Yersiniaenterocolitica的PGL进行了研究后发现:YePL2A可以通过内切作用模式产生聚合度为2~5的寡聚半乳糖醛酸;而YePL2B通过外切作用模式将聚半乳糖醛酸降解为不饱和半乳糖醛酸二糖。为了确定PGL(PelB)对聚半乳糖醛酸的作用方式,Wang等[44]通过HPLC-TOF-MS对终产物进行了分析后发现:在351、527、703和879m/z处显示出主要的强峰,表明其最终产物主要为不饱和半乳糖醛酸(GalpA)的二聚体、三聚体和四聚体,并没有产生任何单体,为典型的内切作用模式。

3.3 蛋白结构与功能

果胶酶的结构和功能有着十分密切的联系。根据CAZy数据库,本文总结了不同PLs家族果胶酶的种类及其主要结构(表4)。目前,已经有大量果胶酶的生化特性得以表征,但是晶体结构得到解析的PGLs和PMGLs仍为少数。值得注意的是,来自PL1、PL3和PL9家族的PGLs和PMGLs均为平行的β-螺旋结构,来自PL2家族的PGLs呈较罕见的(α/α)7桶状结构,而来自PL10家族的PGLs则为(α/α)3桶状结构(表4)。本文将对这3种类型的晶体结构进行简要的分析,以便从结构水平理解其对果胶酶功能产生的不同影响(图8)。

表4 不同PLs家族果胶裂解酶和果胶酸裂解酶的结构

3.3.1β-螺旋

在PL1、PL3和PL9家族中,PGLs和PMGLs均采用相似的β-螺旋结构。具体来看,β-螺旋主要由3个平行的β折叠片(PB1、PB2和PB3)组成,这些β折叠片由3个转角(Turn1、Turn2和Turn3)依次连接而成。一般连接PB1和PB2的T1转角较短,而T2和T3转角是从β折叠片中延伸出来的较长环,它们分别连接PB2和PB3,PB3和PB1[51]。值得注意的是,T3转角通常是较长且构象复杂的环,构成了主环区域;它们从平行的β-螺旋核心突出,与PB1堆积到一起,形成了底物结合裂隙[32,52]。因此,各个PGLs之间的主要区别在于从平行的β-螺旋核心突出并覆盖的环的数量、大小和构象不同[40]。

Bsp165PelA是一种来自Bacillussp. N16-5的新型PGL,它具有与PL1家族其他PGLs相似的特征:平行的β-螺旋结构、活性位点残基和底物结合裂隙。它在三级结构上表现为平行的β-螺旋上有7个完整的环,与其他PGLs最明显的区别在于从核心结构向外延伸的T3长环(图8(a))。Bsp165PelA的T3转角和T1转角在结构几乎没有相似之处。平行的β折叠片PB1一共有10条,PB2和PB3分别有9条和7条[40]。

此外,β-螺旋通常以两端的环开始和结束,称为β-螺旋帽。这个帽子是两亲性的:它的一边有时包含带电残基,暴露在溶剂中;而另一边则覆盖β-螺旋的疏水核心。Bryan等[53]研究认为,帽子不仅可以保护β-螺旋的核心免受溶剂侵蚀,还可以防止β-螺旋的进一步聚集。如,来自Erwiniachrysanfhemi的PelE[23]也可以折叠成中心平行的β-螺旋结构(图8(b));它在N端区域形成了一个由26个氨基酸组成的长环,并沿着平行β-螺旋的一侧折叠,以保护蛋白质内部不受溶剂的侵蚀;而在β-螺旋的C端,多肽折叠成了3个不同的环,其中一个环主要负责覆盖并保护C端免受溶剂的侵蚀。类似地,还有PL1家族来自Acidovoraxcitrulli的PGL(AcPel),它由一个典型的右手β-螺旋和一个Ca2+组成(图8(c)),其中β-螺旋被一个帽子结构所覆盖,其T2转角较短,保守且有序;T3转角比T1或T2转角长,可以形成帽结构域并参与构成活性位点。初级Ca2+位于PB1链和T3转角之间,与底物结合位点密切相关,而位于β-螺旋内侧的酸性残基的侧链相同,指向内部可以起到稳定结构的作用。

(a)~ (c)来自PL1家族的果胶酸裂解酶Bsp165PelA、PelE和AcPel,均呈现典型的β-螺旋结构;(d)和(e)来自PL10家族的果胶酸裂解酶PelA和Pel10A,呈(α/α)3桶状结构;(f)来自Yersinia enterocolitica的PL 2家族果胶酸裂解酶YePL2A,呈现罕见的(α/α)7桶状结构;每个结构图下方标记为对应的PDB号图8 不同PLs家族果胶酸裂解酶的三维结构图Fig.8 Three-dimensional structures of pectate lyase from different PL families

3.3.2 (α/α)3桶状

与PL1、3和9家族中普遍的β-螺旋结构不同,来自PL10家族的PelA[31]和Pel10A具有类似的(α/α)3桶状结构(图8(d)和(e))[54],并且它们都表现为2个域,底物结合和催化残基被认为存在于2个结构域之间开放的中心凹槽处。然而,关于PGLs和PMGLs呈现(α/α)3桶状的报道很少,目前仅PL10家族的上述2种裂解酶的结构得到解析,为其结构的进一步探究提供了重要的信息。

PelA表现为一种环状折叠状态,其结构以α-螺旋结构为主,伴随着不规则的卷曲和短的β链。PelA的384个氨基酸残基,分布在11条反向平行的β链,11个螺旋和6个310-螺旋中,其余残基位于环状和卷曲结构中[31]。PelA的结构显示为2个“结构域”,它们之间的接口是一个宽阔的开放的中央凹槽。与其他内切作用的多糖裂解酶(如木聚糖酶)所报道的一致,该凹槽被认为承载了底物结合位点和催化活性位点。具体来看,PelA的N端“结构域”以短β链和无规卷曲开始,然后是一些螺旋结构,β转角和结构中最大的α-螺旋,其中,前2个螺旋穿过主要由α-螺旋组成的α环的最后一个螺旋,显示出紧密的(α/α)3桶状。C末端的“结构域”主要由短的β链,不规则的环状和最末端的α-螺旋组成,该结构的这一部分比N端结构域更灵活。

3.3.3 (α/α)7桶状

目前,不同PLs家族中关于(α/α)7桶状结构的报道相对较少,其中,来自Yersiniaenterocolitica的PL2家族的PGL(YePL2A)呈现(α/α)7桶状结构(图8(f)),这在原核蛋白中属于首次发现[28]。具体来看,(α/α)7桶状是指将2个反平行的α-螺旋堆积成7个亚结构,其中每个螺旋结构的长度为10~20个氨基酸,这些亚结构以逆时针方向排列构成了桶状结构的核心。

值得注意的是,在YePL2A中这个α桶状结构起着类似结构平台的作用,在这个平台上“嫁接”了2个可以利用催化机制的“大臂”。这些臂主要由β链组成,不仅限定了活性位点通道的壁,还使酶具有整体的“虎钳”形状(“vice-like” shape),并且两条臂之间的距离跨度为~1.5 nm,长度为~5.0 nm,足以容纳寡半乳糖醛酸底物[28]。此外,酶壁区具有充分的灵活性:一般情况下,通道两端都是开放的,而当酶与三半乳糖醛酸底物结合后,这些臂可围绕底物闭合,以充分定位催化中心并进行β-消除反应。

3.4 PGLs和PMGLs的催化机制

PGLs和PMGLs都能通过反式β-消除机制使果胶分子中D-半乳糖醛酸的α-1,4糖苷键断裂。具体来说,这些裂解酶通过攻击底物的糖苷键,在邻近羧基或酯化的羧基一边发生β-消除,即在C4位置上断开糖苷键。同时,在C5位置消去一个H原子,在新形成的低聚半乳糖醛酸盐的非还原端生成不饱和C4和C5键[26,55](图9(a))。

从酸碱质子理论的角度来看:位于活性位点的Ca2+往往起到酸化底物的作用,催化碱从被酸化底物的C5原子中提取质子,从而生成烯醇中间体,催化酸则提供质子以协同作用。在最后一步,离去基团的消除则是通过另一个酸性基团使O4原子质子化来实现的,烯醇中间体则由Ca2+来稳定[55]。根据辅助β-消除的金属离子不同,可以将催化机制分为Ca2+辅助(图9(b))和过渡金属离子辅助型。此外,根据催化碱的不同,可分为Lys型和Arg型β-消除催化机制(图9(c))。

3.4.1 金属离子辅助β-消除反应

3.4.1.1 Ca2+辅助的β-消除机制

大多数PGLs的催化活性都需要Ca2+,图9(b)为常见的Ca2+辅助β-消除机制。PGLs中存在两类Ca2+:初级Ca2+,在没有底物的情况下,可以与酶分子结合;附加Ca2+,是酶和低聚半乳糖醛酸复合物之间的桥梁[40,56-57]。在酶-Ca2+-低聚半乳糖醛酸的复合物中,静电相互作用占主导,低聚半乳糖醛酸盐中带负电荷的部分主要与Ca2+或蛋白质中带正电荷的基团相互作用。

图9 果胶酸裂解酶中的β-消除催化机制Fig.9 The catalytic mechanism of β-elimination in pectate lyase

PGLs降解聚半乳糖醛酸的催化机制是典型的β-消除过程,其基本机制是通过催化碱从一个半乳糖醛酸的C5部分提取质子。Rao等[58]提出:质子提取可能是由于酶活性位点上赖氨酸,导致了C—O键的断裂,并在C4和C5之间形成了双键。他们将酸碱催化理论推广到β-消除反应中,催化碱提取C5质子(假定为赖氨酸)需要一种作用于羧基的催化酸。因此,提出PGL的Ca2+可以作为路易斯酸(Lewis acid)来满足这一要求。首先,Ca2+对羧基的极化作用会使C5处的质子酸化,从而被酶的催化碱提取。其次,由于PGLs的最适pH较高,蛋白质中侧链基团不能满足作为催化酸的要求。虽然Ca2+在大多数含钙金属酶中主要起结构作用,但在某些酶中也具有催化作用。因此,果胶酸裂解酶似乎以Ca2+为路易斯酸、赖氨酸为催化碱来催化β-消除反应。

3.4.1.2 过渡金属离子辅助的β-消除机制

PL2家族来自小肠结肠炎耶尔森菌(Yersiniaenterocolitica)的PGL(YePL2A)呈现罕见的(α/α)7桶状结构和独特的过渡金属辅助β-消除[28]。尽管它的折叠很少见,但YePL2A的催化中心可以与结构上不相关的家族重叠,突出了β-消除机制保守的催化氨基酸结构。YePL2A还具有其他2个特性:①可利用钙以外的金属原子进行催化;②其布朗斯特碱(Brønstead base)呈交替构象,可以直接与底物的糖醛酸基团相互作用。

首先,YePL2A中假定的催化碱(Arg171)从与PL1和PL10家族PGLs相反的方向接近底物。在这种构象中,亚氨基N与底物糖醛酸基团形成了新的相互作用,有助于稳定反应中间体。其次,在YePL2A结构复合物中,金属离子位于底物糖醛酸基团的2个氧原子之间,与PL1和PL10家族的酶相比,它具有更合适的几何形状。此外,还有2种氨基酸在催化中起辅助作用:Arg272参与了O2和O3底物识别,Glu130参与了金属配位。最后,综合考虑生化和结构数据,都强烈支持了YePL2A中过渡金属Mn2+或者Ni2+辅助了β-消除机制。然而,更多关于过渡金属离子辅助β-消除机制的细节仍有待进一步的研究。

3.4.2 Arg作为催化碱的β-消除机制

Ma等[59]探究了PL1家族来自枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的PGL(BsPel)的反式β-消除机制:Arg279作为催化碱可以从底物的C原子中提取质子,从而形成不稳定的碳负离子中间体(图9(c))。该中间体的糖苷键很容易被切割,生成4,5-不饱和二半乳糖醛酸产物和带负电的R1-O-基团。活性位点的3个Ca2+在通过配位相互作用紧密结合底物方面起着至关重要的作用,其中2个Ca2+通过酸化质子促进其转移,并稳定了生成的中间体。Lys247和Arg279则是通过与底物形成氢键来促进催化作用。此外,还证实了Arg284不是潜在质子供体。离去基团的质子来自溶剂水分子,而不是活性位点的任何酸性残基。

3.4.3 Lys作为催化碱的β-消除机制

Alahuhta等[55]研究了PL3家族的PGL(PL3)后发现,Lys108作为β-消除反应的催化碱,却没有明确的催化酸候选物。该反应机制可以通过反平面反式消除反应来解释:其中Lys108从C5原子中提取质子,不需要通过酸性残基提供质子,酸化的水分子则通过质子化底物的O4原子完成反式β-消除反应。除此之外,酸性残基Glu84、Glu39和Asp107参与了Ca原子配位作用:活性中心有3个Ca原子,Glu84是其中2个Ca结合所必需的。Gln111和Arg133参与了底物结合,Arg133则有助于底物的正确定位,其中Gln111对底物结合的影响较小,可能在反应的最后一步稳定了O4原子。

4 结论与展望

首先,对PGLs和PMGLs的来源、分类、生化特性及作用模式等进行了阐述,还对不同PLs家族的相关裂解酶进行了序列比对和进化历程分析,这有助于加深人们的系统认知。其次,为了探究其功能与结构之间的联系,对不同PLs家族PGLs和PMGLs的三维结构进行了分析。目前,PL1、3和9家族的裂解酶均为平行的β-螺旋结构,PL2家族的PGLs呈现较为罕见的(α/α)7桶状结构,而PL10家族的PGLs则为(α/α)3桶状结构。最后,关于催化机制:PGLs和PMGLs都能通过反式β-消除反应裂解果胶分子中的α-1,4糖苷键。从酸碱质子理论的角度来看:位于活性位点的Ca2+往往起到酸化底物的作用,催化碱(通常是精氨酸)从被酸化底物的C5原子中提取质子,从而生成烯醇中间体,催化酸提供质子,在C4和C5之间形成双键从而导致糖苷键的断裂。根据辅助β-消除的金属离子不同,将催化机制分为Ca2+辅助和过渡金属离子辅助;根据催化碱的不同,可分为Lys型和Arg型β-消除催化机制。

总之,作为全球酶市场最受关注的生物催化剂之一,微生物来源的PMGLs和PGLs日益成为食品、造纸和纺织等工业领域的重要候选者。然而,目前关于PMGLs和PGLs的研究主要集中在来源、生化特性及其应用等基础层面,未来的研究将不再局限于新酶的克隆及生化特性的表征等较基础的研究,也许会更多地聚焦于三维结构解析、催化机制的深入研究、酶分子改造和工业化应用等诸多领域。

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