李 婷，张尚文，杨 彬，蒙 平，庾韦花，石 前，张向军

（1.广西农业科学院 生物技术研究所，广西南宁530007；2.广西农业科学院 后勤服务中心，广西南宁530007）

铁 皮 石 斛（Dendrobium officinale）是兰科（Orchidaceae）石斛属多年生草本植物，具有生津养胃、滋阴清热、润肺明目、抗癌、防衰老和增强免疫力等功效，被誉为“中华九大仙草”之首。硒是人体生长发育过程中不可缺少的微量元素，其功能价值越来越受到人们的认可与重视[1-2]。缺硒会导致各种慢性病和地方病频发，补硒具有重要意义[3]。人体所需的硒不能通过自身合成，需从食物中摄取，植物便是很好的硒载体，可将自然环境中的无机硒转化成有机硒[4]。目前，外源硒对各种农产品、中药材产量及品质的影响已有许多研究[5-12]。部分学者开展硒对铁皮石斛生长及原球茎的影响。张艳嫣等[13]对铁皮石斛幼苗叶面喷施不同浓度亚硒酸钠溶液，开展低温胁迫试验，发现0.05～0.10 mg/L外源硒能增强低温胁迫下铁皮石斛幼苗的抗寒性；低温胁迫解除后，0.10 mg/L外源硒能提升铁皮石斛幼苗在恢复生长期的综合抗氧化防御能力。陈丽璇等[14]对温室中铁皮石斛叶面喷施不同浓度外源亚硒酸钠，发现5.0～7.5 mg/L外源亚硒酸钠处理下，铁皮石斛生长良好，鲜条硒和多糖含量高。徐国华等[15]通过在培养基中添加亚硒酸钠溶液，研究不同浓度硒对铁皮石斛组织培养拟原球茎生长及抗氧化系统的影响，发现适量的硒浓度能促进铁皮石斛拟原球茎的增殖生长。杨善岩等[16]以铁皮石斛原球茎为载体进行硒元素富集，发现培养时间、温度、硒浓度、NAA浓度、KT浓度和光照强度6个因素中，硒浓度、培养时间和光照强度对原球茎的富硒能力有显著影响。

课题组前期对铁皮石斛中硒的形态进行测定，硒在铁皮石斛鲜条中主要以硒代胱氨酸和硒蛋氨酸的形态存在[17]。关于硒对铁皮石斛组培苗超氧化物歧化酶（SOD）活性影响还未见报道。本研究以铁皮石斛组培苗为材料，设置不同浓度硒处理，探讨硒对铁皮石斛组培苗生长及其SOD活性的影响，及增加硒元素后对其多糖和叶绿素含量的影响，摸索合适的硒浓度，为广西铁皮石斛富硒标准化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为广西壮族自治区农业科学院生物技术研究所药用植物利用研究室选育的铁皮石斛生根组培苗（桂斛1号）。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计

设置硒浓度为0（对照）、0.1、1、10和100 mg/L，共5个处理；培养基为MS+6-BA（0.5 mg/L）+NAA（0.1 mg/L）+4%琼脂+30%蔗糖。将高约3～4 cm的铁皮石斛组培苗接种到含硒的培养基中。每处理接种30瓶，每瓶3株，重复3次，60天后统计成活数（3株组培苗均成活的瓶子数），观察记录硒处理后铁皮石斛组培苗的株高和叶片颜色；选取整株铁皮石斛组培苗，随机选取新鲜枝条，测定SOD活性、硒含量及叶绿素含量。

1.2.2 指标测定

参照GB 5009.93—2017[18]，采用双道原子荧光光度计检测新鲜枝条硒含量及新鲜枝条烘干磨成粉后的硒含量；采用G6PDH活性检测试剂盒（WST-8法）测定新鲜枝条的SOD活性；分别参照《中华人民共和国药典》[19]、NY/T 3082—2017[20]测定新鲜枝条的多糖和叶绿素含量。

1.3 统计分析

采用Excel 2003和DPS 18.10软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 硒处理对铁皮石斛组培苗生长的影响

随硒浓度增加，成活数和成活率逐渐降低（表1）。硒浓度为0.1和1 mg/L时，成活数分别为27.67和25.00，成活率分别为92.22%和83.33%，均与CK差异不显著；硒浓度为10和100 mg/L时，成活数分别为22.67和16.33，成活率分别为75.56%和54.44%，均与CK差异显著（P＜0.05）。

表1 不同硒浓度对铁皮石斛组培苗成活率影响Tab.1 Effects of different Se concentrations on survival rates of D.officinale tissue culture seedlings

随硒浓度增加，培养基的颜色逐渐加深（图1）。硒浓度为0.1 mg/L时，培养基的颜色与CK差别不大；硒浓度大于1 mg/L时，培养基的颜色均为红褐色。随硒浓度增加，叶片颜色表现为浅绿色、绿色、深绿色、黄绿色和黄绿色。低浓度硒对组培苗生长影响不大；高浓度硒对组培苗生长影响较大，组培苗出现黄叶、枯死的现象。

图1 不同硒浓度对铁皮石斛组培苗生长的影响Fig.1 Effects of different Se concentrations on growths of D.officinale tissue culture seedlings

随硒浓度增加，组培苗平均株高、叶片数、平均叶片长、生根数和平均根长均呈先增后减的趋势（表2）。硒浓度为1 mg/L时，平均株高、叶片数、平均叶片长、生根数和平均根长均最大（7.88 cm、7.33、2.64 cm、6.33和0.94 cm），平均株高显著高于其他浓度（P＜0.05）；硒浓度为10 mg/L时，平均株高、叶片数、平均叶片长、生根数和平均根长均减少；硒浓度为100 mg/L时，平均株高、叶片数、平均叶片长、生根数和平均根长均最小（6.47 cm、2.33、0.38 cm、0.33和0.06 cm），生长近乎停滞。

表2 不同硒浓度对铁皮石斛组培苗生长的影响Tab.2 Effects of different Se concentrations on growths of D.officinale tissue culture seedlings

2.2 硒处理对铁皮石斛组培苗硒含量及多糖含量的影响

随硒浓度增加，组培苗硒含量增加（图2）。硒浓度为0.1 mg/L时，硒含量最低（1.25 mg/kg）；依据富硒农产品硒含量分类要求里的规定（硒含量合理值为0.15～2.00 mg/kg），硒含量在标准范围里；硒浓度为100 mg/L时，硒含量最高（24.88 mg/kg）。

图2 不同硒浓度对铁皮石斛组培苗硒含量的影响Fig.2 Effects of different Se concentrations on Se contents of D.officinale tissue culture seedlings

随硒浓度增加，多糖含量呈先增后减的趋势（图3）。硒浓度为1 mg/L时，多糖含量最高（16.98 g/100g）；硒浓度为100 mg/L时，多糖含量最低（5.93 g/100g）。

图3 不同硒浓度对铁皮石斛组培苗多糖含量的影响Fig.3 Effects of different Se concentrations on polysaccharide contents of D.officinale tissue culture seedlings

2.3 硒处理对铁皮石斛组培苗SOD活性和叶绿素含量的影响

随硒浓度增加，SOD活性呈先升后降的趋势（图4）。硒浓度为1 mg/L时，SOD活性最高（60.70 U·g-1·min-1）；硒浓度为100 mg/L时，SOD活性最低（50.95 U·g-1·min-1）。

图4 不同硒浓度对铁皮石斛组培苗SOD活性的影响Fig.4 Effects of different Se concentrations on SOD activities of D.officinale tissue culture seedlings

随硒浓度增加，叶绿素含量呈先增后减的趋势（图5）。硒浓度为1 mg/L时，叶绿素含量最高（0.84 mg/g）；硒浓度为100 mg/L时，叶绿素含量最低（0.25 mg/g）。

图5 不同硒浓度对铁皮石斛组培苗叶绿素含量的影响Fig.5 Effects of different Se concentrations on chlorophyll contents of D.officinale tissue culture seedlings

3 讨论与结论

本研究中，适当硒浓度处理下，铁皮石斛组培苗的成活率与CK差异不显著，适当硒浓度还能促进铁皮石斛组培苗叶片生长、根系发育。SOD是植物体内重要的抗氧化酶，催化超氧阴离子发生岐化作用，生成H2O2和O2，在植物逆境生理生化过程中具有重要作用[21]。本研究中，随硒浓度增加，SOD活性呈先升后降的趋势，说明适当硒浓度能增强铁皮石斛组培苗SOD活性。武芸等[22]通过在培养基中添加不同浓度的亚硒酸钠溶液，研究硒对荸荠（Heleocharis soloniensis）组培苗生长及SOD和POD活性的影响，发现适当浓度的硒能提高SOD和POD活性，促进生长，与本研究结果一致。李亚敏等[23]研究硒对高温胁迫下萝卜（Raphanus sativus）幼苗叶绿素含量和酶活性的影响，发现施硒提高叶片总叶绿素含量，降低SOD活性。这可能与硒作用方式的多样性、抗氧化酶作用底物的关联性及不同抗氧化酶间的协同作用差异有关。

叶绿素是植物进行光合作用所需的重要物质之一，决定植物的光合作用效率。研究表明，施加低浓度硒可影响植物叶绿体的结构与功能、能量代谢、氧化系统及光合作用等方面[24]。植物受到环境胁迫时，硒可降低活性氧自由基的含量，活化抗氧化物质，修复受损的叶绿体结构及增加其他重要代谢物含量，使光合作用得以修复[24]。本研究中，随硒浓度增加，叶绿素含量呈先增后减的趋势，与周大寨等[25]研究不同土壤硒浓度对花椰菜（Brassica oleraceavar.botrytis）幼苗期叶绿素含量的影响，刘燕等[26]研究硒对铅胁迫下油菜（B.napus）叶绿素含量的影响结果相似。说明适当硒浓度有利于铁皮石斛组培苗叶绿素积累。

铁皮石斛含多糖、生物碱、菲类、联苄类和氨基酸等多种活性成分[27]；其中，多糖为主要的活性成分，是含量最高的物质[28]。随硒浓度增加，铁皮石斛组培苗多糖含量呈先增后减的趋势。说明适当硒浓度有利于铁皮石斛组培苗多糖积累。

本研究中，硒浓度为0.1 mg/L时，铁皮石斛组培苗成活率最高，硒含量处于标准范围值，SOD活性较高；硒浓度为1 mg/L时，铁皮石斛组培苗成活率较高，硒超出标准范围值，SOD活性及叶绿素含量均达到最大值。适当硒浓度可在一定程度上促进铁皮石斛组培苗生长，增强SOD活性、促进叶绿素合成及增加多糖含量；过量的硒浓度会破坏铁皮石斛组培苗的正常生长，各生理生化指标下降。硒浓度小于1 mg/L时，对铁皮石斛组培幼苗生长较为有利。后续将开展细化硒浓度为0.1～1 mg/L的梯度试验，找出最合适铁皮石斛组培苗生长的硒浓度。