张瑞强，马国虎，繁萍，骆寅梅，赵永智，冶蕊，巨雪燕，董芊里

(青海大学农牧学院，青海 西宁 810016)

青海地区放牧家畜的消化道寄生线虫主要以奥斯特线虫、细颈线虫、捻转血矛线虫、夏伯特线虫和毛首线虫等为主，引起家畜慢性消耗性疾病[1-3]，降低饲料的有效利用率[4]。传统的家畜线虫检测方法分为形态学方法、免疫学和分子生物学技术方法等[5]，这些方法的不足之处是检测目标单一，工作量大和对动物损伤度高。现代兽医诊断学的发展趋势是微创或无创精准检测，而且基于动物群体庞大的实际状况能通过群体的检测来降低工作量。粪便是许多寄生虫生活史或一过性停留的载体，是开展多种寄生虫病原高通量检测的较理想样本。2018年底，Cannon等[6]用改进的扩增子技术分析了人源和环境源样本中的单细胞和寄生生物，测序平台通过使用优化的联合探针锚定聚合技术，在DNA聚合酶的催化下，DNA分子锚和荧光标记核苷酸进行聚合，在激光的作用下荧光信号被激发，随后高分辨率成像系统对光信号进行采集，光信号经过数字化处理后，获得当前待测碱基的信息，从而完成测序，该技术为开展寄生虫群体检测研究提供了思路。

本研究选用参考文献[6,7]中的两对线虫引物，以青海省内不同地区的牦牛和藏羊粪便样本为研究对象，初步探索了基于联合探针锚定聚合技术的高通量测序检测方法在寄生线虫上的检测效果，对家畜粪便中线虫种系进行了分析鉴定。

1 材料

1.1 粪便样本

2021年8月在青海省海晏、贵南、泽库和河南四县，共采集了155份牦牛和藏羊粪便样本，低温运送回实验室保存。各县不分动物种随机取样2份，每份样本约10 g，共8份混匀成1份，然后分装后分成3份，干冰保存寄送上海美吉生物公司。

1.2 试剂

磁珠法粪便DNA提取试剂盒、粪便DNA样本保存管、M5 Marker i DNA Marker与2×M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix (with blue dye) 购买于北京聚合美生物科技有限公司。GeneGreen核酸染料与琼脂糖购买于天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 引物

用于钩虫基因PCR的引物如下：5'-CTTTGTCGGGAAGGTTGG-3'与5'-TTCACCACTCTAAGCGTCT-3'[7]；线虫锚定高通量测序引物A序列如下：5'-CACCCGTGAGGATTGACAG-3'与5'- CGATCACG'GAGGATTTTCA-3'[6]；线虫锚定高通量测序引物B序列如下：5'-CGTCATTGCTGCGGTTAAAA-3'与5'-CCGTCCTTCGAACCTCTGAC-3'[6]；4对引物委托赛默飞旗下Invitrogen公司合成。

2 方法

2.1 基因组提取

选取粪便样本约220 mg，按照磁珠法粪便DNA提取试剂盒说明书进行操作。

2.2 测序

锚定高通量测序工作委托上海美吉生物医药有限公司完成，测序工作包括样本DNA质检、样本DNA建库和上机测序、初始序列优化及注释等。

2.3 PCR扩增及电泳检测

PCR反应体系：样本基因组DNA 1.0 μL，正反向引物(10 nM)各1.0 μL，2×Taq PCR MasterMix Ⅱ 10.0 μL，补ddH2O至20.0 μL。反应程序：94 ℃预变性5 min，然后94 ℃变性30 Sec，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸5 sec，循环35次；再72 ℃ 10 min，4 ℃保温。100 bp～750 bp的DNA Maker和样品各使用5.0 μL，电泳电压不超过80 V，电泳结果拍照片，并用photoshop 6.0加标注。

2.4 数据统计分析

将实验数据导出填写到表格中，运用 Microsoft Office Excel软件处理实验数据。

3 结果

3.1 锚定高通量测序结果

通过对两对线虫特异性引物做锚定高通量测序发现，青海四县区粪便样本DNA的扩增结果如图1和图2，各样本均有不同长度的扩增条带。经高通量测序后注释的生物分类如表1，其中已确认的动植物线虫检出率为37.34%，属于家畜已知的寄生线虫为钩口属和血矛属。

图1 锚定高通量测序引物扩增结果

图2 四县区内样本中生物属水平群落丰度

锚定高通量引物是基于18 S rDNA设计，基本覆盖大多数已知线虫[6]，两对引物的测序结果共156条有效OTU，确认属的线虫OTU数为36。有8个已知细菌属，其余均为未知生物序列。

表1 锚定高通量测序结果

3.2 PCR扩增的电泳结果

钩口属引物为文献报道[7]的特异性引物，可以区分多种不同动物源钩虫种。PCR扩增结果如图3，目的片段大小如文献叙述，介于404bp-408bp间。

图3 钩口属片段扩增结果1-7、9、11、12和16判定为阳性结果，M为Marker

3.3 四县区样本扩增阳性率

海晏县2份牦牛样本、6份藏羊样本呈阳性；贵南县没有阳性样本；泽库县1份牦牛样本、2份藏羊样本呈阳性；河南县4份牦牛样本呈阳性。图3是四县区部分粪便样本中钩口属线虫的PCR扩增结果，阳性样本扩增目标条带与预期片段大小相似。

各县区全部牦牛和藏羊样本中钩口属线虫总的阳性率为9.68%，其中河南县牦牛和藏羊全部粪便的阳性率为6.90%，泽库县牦牛和藏羊全部粪便的阳性率为8.82%，贵南的为0，海晏县最高，为25%，显著高于其他地区(p<0.01)。从动物阳性率看，钩口属线虫在牦牛中的阳性率(8.33%)低于在藏羊中的阳性率(11.27%)(p<0.05)。

表2 各县区样本阳性率统计表

4 讨论

本研究基于消化系统内寄生虫种类多的常识，以高通量测序技术为依托，初步探索限定于小范围的寄生虫种群或单细胞种群的引物检测效果[6]，进行检测试验。因引物特别锚定于小范围寄生虫群及一些单细胞生物群，与常规扩增子针对特定序列片段有明显的区别，所以称为锚定高通量测序。本研究首选了针对线虫的引物，对青海省内四县采集的动物粪便样本做锚定高通量测序检测，结果中的156个有效操作分类单元(Operational Taxonomic Units，OTU)，确认属的线虫OTU数为36个，集中于钩口属和血矛属。还有8个已知细菌属，应该属于错误扩增测序，其余OTU均为未知生物序列。因此有效的检出率为37.34%，这个效率从数字上来看并不高，因为有112个OTU为未知生物，即可检索物种数据库中没有相关生物记录。

再从线虫角度来看，我们选用的引物扩增范围是线虫，没有动物源和植物源的区分；加上本研究所用粪便样本为放牧的草食家畜，粪便中出现植物线虫不可避免，所以检出线虫的效率不能仅限于动物源线虫，因此从已知线虫的数据库比对来说 这种锚定高通量测序在寄生虫检测中有很好的优势。

本研究中，可确认属的动物源线虫主要是钩口属和血矛属，这两种线虫均属于人兽共患病原[8]。已知牛羊可作为钩虫的转续宿主[9]，人生食了这类含有虫卵的牛羊肉食品，极易感染。为了进一步验证动物线虫的检出准确性，选用已有文献中验证的钩虫属引物[7]，对样本中钩虫进行PCR扩增，155份样本中有9.38%扩增阳性，总体阳性率不高；其中牦牛样本阳性率为8.33%，而藏羊样本的阳性率为11.27%，高于牦牛样本。从县区来看，海晏县样本阳性率(25%)高于其他县的样本阳性率，而贵南县阳性率为零。已知这些县区都在不同时间建立了有机牧场，发展有机畜牧业，从时间上来看，贵南县、河南县和泽库县建立时间较长，有机牧场的建立与线虫的阳性率可能存在一定关联，还需要深入研究。总之，本研究结果一方面初步验证了锚定高通量测序在限定范围内寄生虫检测中有较好的鉴定分析效果，另一方面也提示本研究样本采集地区应加强钩口属和血矛属线虫的预防，从而阻断相关寄生虫病的发生和传播。