铁皮石斛的抗氧化、保湿功效研究和应用现状

2023-01-15陈漪汶黄健聪张淑瑶郑雅莉谢小保

广州化工 2022年13期

陈漪汶，文霞，黄健聪，张淑瑶，郑雅莉，2，谢小保

(1 广东省科学院微生物研究所，广东省微生物分析检测中心，华南应用微生物国家重点实验室，广东省菌种保藏与应用重点实验室，广东广州 510070；2 广东迪美新材料科技有限公司，广东肇庆 526238)

铁皮石斛，隶属兰科石斛属，常生长于海拔达1000多米的山地，喜温暖湿润气候和较为阴湿的环境，在我国主要分布在安徽、浙江、广西等地[1]。铁皮石斛被奉为中华九大仙草之首，是《中华人民共和国药典》中明确记载的5种石斛属植物之一。

铁皮石斛的神奇功效在中国古代医学典籍中已有多处详细的记载，如在《本草纲目》中称铁皮石斛具有增强机能，调理肠胃等功效。在美容方面，铁皮石斛也呈现出优越的抗氧化、抗衰老、保湿、抗炎等多重护肤功效[2]。当下中国化妆品市场主流趋势为：天然、绿色、功效护肤。因此，铁皮石斛在化妆品领域的潜在应用价值受到了国内外研究者们的广泛重视。尤其是近年来，铁皮石斛的护肤功效和应用研究俨然成为了当前化妆品开发的一个新热点。

1 铁皮石斛多糖及其功效

1.1 铁皮石斛多糖

铁皮石斛最主要的活性成分是多糖类，也是衡量铁皮石斛品质优劣的一项重要指标。与其它品种的石斛相比，铁皮石斛在多糖含量方面占据绝对优势。《中国药典》中规定，铁皮石斛多糖含量不得少于25.0%。铁皮石斛含有高浓度的粘液多糖，铁皮石斛中多糖积累越多，则粘度越高，相应的多糖活性就越强，产品也更优质[3]。

不同产地、不同采收时期、不同部位的铁皮石斛多糖含量各异。如铁皮石斛茎中多糖含量约为铁皮石斛叶的2～4倍[4-5]；其次，代谢水平会影响多糖得率，如铁皮石斛在4月份左右(开花前)采收可获得更高含量的铁皮石斛多糖，相对应地，二年生的铁皮石斛更容易达到多糖标准含量的要求[5]。

铁皮石斛中多糖成分有葡甘露聚糖，可占粗多糖组分干重的58.3%。其单糖组成主要包括甘露糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和鼠李糖等[6-7]。He等[7]从铁皮石斛茎中提取的水溶性多糖，其含量高达367 mg/g。经水解和HPLC分析可知，水溶性多糖的主要单糖成分为甘露糖，其含量为257 mg/g，葡萄糖和半乳糖次之，其含量分别为55 mg/g和1 mg/g，这表明铁皮石斛水溶性多糖主要为甘露聚糖。铁皮石斛叶中以酸性杂多糖居多，经HPLC-ESI-MS鉴定可知，14个不同产地的铁皮石斛多糖相对含量差异较大，但其单糖构成相似，均以葡萄糖、甘露糖、半乳糖为主，其中尤以甘露糖占比最多[4]。铁皮石斛叶经热水提取、醇沉和色谱柱处理后，可分离出两种平均分子量分别为28，342 Da和41，143 Da的多糖组分DLP-1和DLP-2。由GC-MS分析得知，DLP-1的单糖摩尔比为半乳糖:阿拉伯糖:鼠李糖=3.21:1.11:0.23；DLP-2的单糖摩尔比为葡萄糖:半乳糖=3.23:1.02[8]。Luo等[9]通过水提醇沉法提取，并进一步采用层析技术分离出一种分子量为8500 Da的铁皮石斛多糖DOP，其单糖摩尔比为甘露糖:葡萄糖:阿拉伯糖与:半乳糖醛酸=6.2:2.3:2.1:0.1。原子力显微镜表明，DOP主要以棒状链形式存在，有利于多糖高聚合度结构。

1.2 铁皮石斛多糖的抗氧化功效

情绪和身体压力、不良饮食习惯、环境污染等都可能会导致机体中自由基失衡，当自由基在人体内累积过多时，自由基会打破生物体内的代谢平衡，导致皮肤老化和其他皮肤疾病[10]。内源性抗氧化剂可能不足以抵消自由基的负面影响，而天然抗氧化剂具有来源广泛、天然无毒、安全高效等优势，这引起了业内对天然抗氧化剂极大的兴趣和关注[11]。大量研究表明，天然多糖、维生素、多酚类等成分都有清除生物体内自由基的体内外抗氧化活性。

已有文献报道，铁皮石斛多糖可通过阻断自由基反应链、增强机体的抗氧化防御系统、下调炎症相关因子的表达等来发挥抗氧化作用[12]。Huang等[13]采用H2O2诱导巨噬细胞氧化损伤模型来评估铁皮石斛多糖的抗氧化能力，结果表明，铁皮石斛多糖能显著提升巨噬细胞活力，降低细胞凋亡率和病变率。这证实了铁皮石斛多糖对氧化损伤具有温和的免疫刺激活性和保护作用，这种生物活性可能与其(1→4)-β-D- Manp、O-乙酰基等结构以及高比例的甘露糖组成有关。

Luo等[9]的研究显示，当铁皮石斛多糖DOP的浓度为50-800 μg/mL时，随着DOP的浓度增加，DOP的螯合能力由6.3%提升至85.2%，这表明DOP能够通过螯合作用来抑制Fe2+介导的氧化反应链。Xing等[14]采用Fe3+还原和·O2-、DPPH和·OH自由基清除试验来综合评估四种铁皮石斛多糖组分DOP-40、DOP-50、DOP-60和DOP-70的体外抗氧化活性。结果表明，DOP-70组分的抗氧化能力最强。当作用浓度为5 mg/mL，DOP-70的还原能力能达到抗坏血酸的76.4%，对O2-、DPPH和·OH的清除率分别为65.3%、70.3%、69.5%，相应的IC50值为2625.6 μg/mL、2395.8 μg/mL、2081.7 μg/mL。水提醇沉脱蛋白处理后的铁皮石斛粗多糖经H2O2-Vc-Fe2+降解得到6种多糖组分，这7种多糖(含降解前后的多糖成分)的分子量从11.10 kDa到652.29 kDa不等，所有DOPs均呈剂量依赖性地表现出良好的DPPH、·OH自由基清除能力。其中，分子量最大的活性多糖显现出了最好的抗氧化活性，这表明DOPs对DPPH、·OH的清除能力与其分子量之间存在一定的联系[15]。

核因子红系2相关因子2 (NRF2)信号通路是减轻ROS的氧化损伤、抑制胃癌(PLGC)扩散的重要途径。在MNNG诱导大鼠PLGC模型中，给予一定剂量的DOP能够显著上调NRF2及其下游II期解毒酶HO-1和NQO-1的表达，通过清除ROS来削弱对机体的氧化损伤，结果也证实了给药处理后的氧化损伤标志物8-OHdG水平确实显著降低[16]。

王玲等[17]从组织培养和野生的铁皮石斛中提取得到的粗多糖类物质均呈浓度依赖性地表现出清除自由基以及抑制脂质过氧化产物丙二醛(MDA)生成的体外抗氧化活性。研究表明，给果蝇喂食一定剂量的铁皮石斛多糖，30天后果蝇体内的两种抗氧化酶SOD和CAT活力均显著升高，且MDA积累减少，果蝇的平均寿命和逆爬行能力均相应得到提升[18]。

1.3 铁皮石斛多糖的保湿功效

皮肤是人体最大的器官，皮肤存在着一个天然的保湿系统。角质细胞是表皮层中的主要细胞类型，含有天然保湿因子(NMF)，NMF主要由氨基酸及其衍生物组成，在皮肤保湿方面发挥重要作用。保湿是维持皮肤健康的必要条件。角质层的水分含量一般维持在10%～20%之间，当角质层的水分含量低于10%时，皮肤会变得粗糙、干裂、松脆而缺乏弹性[19-20]。因此，一切护肤型化妆品的最基本功效是保湿。而多糖类物质含有大量的亲水性羟基，吸水性强，且具有良好的成膜性，可有效锁水保湿，因而被广泛应用于护肤产品的保湿成分。目前市面上的护肤产品大多数是添加透明质酸、甘油、胶原蛋白等保湿成分[21-22]。

研究证实，铁皮石斛多糖提取物与透明质酸的保湿效果没有明显差别，6 h内能达到50%吸湿率；人体功效评价实验结果表明，添加了20 μg/mL铁皮石斛提取物的化妆品就有较为明显的保湿效果；体外细胞实验结果表明，添加剂量为 200 μg/mL铁皮石斛提取物的保湿效果与1000 μg/mL透明质酸钠相近，且细胞活力可恢复至60%以上。这证明了铁皮石斛提取物起到抵御干燥作用，有助于形成保护屏障[23]。实验结果表明，铁皮石斛多糖溶液在6 h内表现出与同等质量比的甘油相当的保湿效果，添加了0.5%铁皮石斛多糖的保湿水与未添加组相比含水量和油分改善率均增加了5%，表现出更优的保湿性能[21]。

2 铁皮石斛酚类化合物及其功效

2.1 铁皮石斛酚类化合物

铁皮石斛含有黄酮、联苄、菲、蒽醌和倍半萜等酚类物质，是发挥抗氧化、抗炎、免疫调节作用的主要功效成分[24]。这类化合物中的酚羟基结构具有强还原性，能作供氢体淬灭自由基，因此酚类可作为天然抗氧化剂应用于各类护肤产品中，以减少氧化损伤带来的皮肤问题[25]。

铁皮石斛不同器官各司其职，因此各大类代谢产物含量差异较大。比如，与茎相比，铁皮石斛叶能够积累更多的多酚类代谢产物[26]。铁皮石斛黄酮含量大小顺序为花>叶>茎>根部[27]。不同产地由于气候、光照等环境条件不同，也会造成铁皮石斛黄酮类化合物在组成和含量上的差异[28]。

Zhou等[28]从不同产地的25种铁皮石斛中分离鉴定出7种黄酮C-苷和2种黄酮O-苷。结果表明，部分黄酮苷成分具有地域性。不同产地铁皮石斛黄酮苷含量存在差异。比如异佛莱心苷仅在广南地区检出，浙江本地铁皮石斛中不含芦丁。因此异佛莱心苷和芦丁可作为区分来源的标志性成分。铁皮石斛各部位黄酮类成分构成相近，且都以芹菜素类居多[29]。Zhang等[24]从11种铁皮石斛叶片的甲醇提取物中鉴定出了14种酚类成分，包括芦丁、维采宁-2、异夏佛托苷等，其中仅有芦丁为槲皮素型黄酮醇，其他均为芹菜素型黄酮，其分子量从534.47～610.52 Da不等。其中，芦丁含量与总黄酮量之间存在较强的正相关关系，这表明芦丁是铁皮石斛叶中最主要的黄酮类成分。

2.2 酚类化合物的抗氧化功效

研究表明，铁皮石斛叶的甲醇提取物对DPPH的清除作用与总黄酮含量之间存在较强的正相关关系。DPPH/ABTS+-HPLC-UV筛选试验证明，芦丁是最主要的抗氧化成分，甲醇提取物DPPH自由基清除率与芦丁含量存在明显的线性关系。铁皮石斛叶中高含量的芹菜素类黄酮也具有清除DPPH/ABTS+的体外抗氧化活性[24]。

李燕等[30]从铁皮石斛中分离出了17种酚类化合物并测试其体外抗氧化活性。结果表明，二氢黄酮类等特殊结构的酚类物质能表现出较强的DPPH清除能力，甚至能达到与Vc相近的处理效果。Li等[31]从铁皮石斛茎中分离出的联苄衍生物——dendrocandin E能表现出比Vc更强的DPPH清除效果。体外抗氧化试验结果表明，从云南产铁皮石斛叶中所分离出的黄酮类成分牧荆葡基黄酮-2″-O-鼠李糖苷具有清除DPPH、ABTS+的体外抗氧化活性，可削弱·OH导致的MSC细胞氧化损伤[32]。邵尉采用加热回流法提取的铁皮石斛花黄酮含量为1.74%，在相同浓度条件下对DPPH、·OH的清除效果优于Vc，其IC50值分别为0.4 μg/mL和25.8 μg/mL；铁皮石斛茎黄酮和叶黄酮含量分别为0.05%、0.20%，在相同浓度条件下对·OH的清除效果优于Vc，其IC50值为12.1 μg/mL和 18.3 μg/mL；铁皮石斛花、叶、茎黄酮提取物均表现出Vc更强的还原力，其自由基清除能力也远高于多糖提取物[33]。

3 其他生物活性成分及功效

铁皮石斛富含多种氨基酸成分，基本涵盖了所有的人体必需氨基酸和非必需氨基酸。曲继旭等[34]对铁皮石斛等三种石斛的氨基酸进行分析得出，铁皮石斛氨基酸含量为40.983 mg/g，高于多数蔬菜水果；必需氨基酸占比为32.55%。因此，铁皮石斛是一种优质的植物蛋白来源和天然的保湿成分。铁皮石斛中还含有具抗氧化、抗炎、抑菌效用的生物碱成分，能协同增强机体抗氧化能力。铁皮石斛中生物碱主要包括大麦芽碱、异柚葡糖苷、哌啶、奎宁、异半卟啉、甜菜碱、可可碱和葫芦巴碱等，其含量为0.0190%～0.0430%[26-35]。此外，铁皮石斛还富含人体所需的各种矿物元素，其含量多高于其他中草药成分，有利于与其他生物活性成分协同发挥效用[36-37]。但目前国内外铁皮石斛对其他活性成分关注较少，其具体功效机制尚不明晰。

4 提取工艺对功效的影响

提取工艺直接影响铁皮石斛提取物的质量、功效成分的提取率、纯度、生物活性，进而导致提取物有效成分浓度和实际作用效果的差异。

4.1 多糖类的提取工艺

热水浸提是最常用的铁皮石斛多糖提取方法，但传统热水浸提法存在浸提时间长、用水量大等局限性，为了提高提取效率通常其他方法联合使用，比如超声法、微波法、生物酶解法等。

缪园欣等[38]采用超声波-微波协同辅助提取铁皮石斛花多糖并评估其抗氧化功效。当提取体系料液比为1:50(g/mL)，超声处理时间为55 min，微波处理功率和时间分别为450 W、 3 min时，多糖的提取效率达到最高。经测试，铁皮石斛花多糖提取物具有强大的DPPH清除能力，其IC50值小于0.1 mg/mL，与Vc相近。超声波、微波的机械效应可以快速缩短提取时间，增加净产出。但该方法经实践后所得到的铁皮石斛多糖产率却偏低(7.22%)，这可能与超声的改性作用有关。

薛燕等[39]采用复合酶法提取铁皮石斛多糖并展开了系统的工艺优化。当提取体系料液比为1:120，初始pH为6.0，复合酶(中性蛋白酶和纤维素酶)浓度比为2:1，酶添加量为10%时，在55 ℃下累计酶解3 h后可收获43.85%铁皮石斛多糖；与水提法相比，酶法提取的铁皮石斛多糖能表现出更优越的DPPH、ABTS+清除能力。李坚等[40]采用乳酸菌发酵提取铁皮石斛多糖并展开了系统的工艺优化。当投料比为1% (g/mL)，发酵液初始pH为6.0时，在37 ℃下累计发酵72 h后可收获45.5%铁皮石斛多糖。通过人体试验评估铁皮石斛多糖提取物的保湿功效，结果显示，在持续使用添加发酵铁皮石斛多糖的样品28天后，志愿者们的肌肤含水量显著提高了48.01%。与其他提取方法相比，酶提法可有效增加细胞壁的通透性，有利于功效成分的流出和提取，兼具温和、安全、高效的优势。而微生物发酵法则为铁皮石斛提取提供一个新方向，微生物中丰富的酶系可加速铁皮石斛细胞壁的破坏和胞内活性物质的释放，且可通过生物转化降解潜在的有害物质，并生成有益的次生代谢产物，有利于提高铁皮石斛功效成分的提取率和活性[41]。有研究表明，铁皮石斛多糖经微生物发酵后可降解为低聚糖或单糖，增加体系中羟基的暴露量，增强了其抗氧化活性[42]。

Liang等[43]以氯化胆硷和甘油配制的深共晶溶剂作为提取剂，采用酶辅助提取铁皮石斛多糖，结果表明，以深共晶溶剂作提取剂比水提能获得更高产量的铁皮石斛多糖，在保证其抗氧化活性的同时，还兼具环保、性能稳定等优势。对提取工艺进行单因素优化，结果显示，当氯化胆硷和甘油摩尔比、提取温度、提取时间、酶浓度分别为1:8、30 ℃、120 min、6 mg/mL时，铁皮石斛多糖产率最高。

He等[44]综合比较了不同提取方法对铁皮石斛茎多糖提取效果的影响。结果表明，采用冻融冷压法提取得到的多糖产量较高，可达到20.33%，这可能是频繁的冷冻和快速解冻促进了细胞壁的破坏和溶解。经表征得知，采用冻融冷压法的铁皮石斛多糖中碳水化合物含量较高，且不含硫酸盐、蛋白质和糖醛酸。HPGPC结果表明，采用冻融冷压法的铁皮石斛多糖分子链完整强，且其清除ABTS+、H2O2和螯合Fe2+的抗氧化活性最好，尤其是在H2O2清除能力方面远远胜过强抗氧化剂Vc。

4.2 酚类化合物的提取工艺

铁皮石斛中酚类物质的提取对溶剂的选择有一定的要求，多采用有机溶剂进行提取以减少水溶性成分的干扰。一般采用的提取技术有加热回流法、超声波、微波辅助提取、生物酶解法等。

黄琴等[25]测试了乙醇、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇这四种有机溶剂对铁皮石斛的黄酮和多酚类物质提取效率及其抗氧化作用的影响。结果显示，氯仿提取物中总酚(以没食子酸定量)和黄酮效价最高，分别为4.10%和10.45%；且能表现出最强的ABTS+、DPPH清除活性和还原能力。Lu等[45]系统地优化了铁皮石斛黄酮提取工艺并评估其抗酪氨酸酶活性。经优化后，体系中固液比为1:50(g/mL)，乙醇溶剂的浓度为78%，期间分6次提取，提取时间设定为2 h，在此条件下总黄酮含量可达到0.7 g/L。经测试，与β-熊果苷相比，所得到的总黄酮提取物能表现出更强的酪氨酸酶抑制活性，且对单酚酶活性的抑制效果强于二酚酶。这可能是因为黄酮提取物可以通过终止自由基反应链从而削弱自由基介导的L-酪氨酸酶对L-酪氨酸的催化作用。

高海立系统地优化了铁皮石斛叶黄酮的超声辅助复合酶法提取工艺。经优化后，体系中液料比为30:1(V/m)，乙醇溶剂的浓度为45%，超声处理功率和时间分别为100 W、10 min；复合酶(纤维素酶和木瓜蛋白酶)浓度比1.5:1，酶浓度为1%、反应温度为55 ℃、反应时间为60 min，相应的叶黄酮得率能达到1.81%。经测试，叶黄酮提取物均呈浓度依赖性地表现出对DPPH、·OH、ABTS+的清除能力，以及还原Fe3+、螯合Fe2+的体外抗氧化活性；经大孔树脂纯化后的叶黄酮纯度和含量均得到显著提升，其抗氧化活性也明显增强[46]。Lin等[42]系统比较了铁皮石斛经混合菌发酵前后的提取物质量的变化。将酵母菌、乳杆菌和枯草芽孢杆菌按照1:1:1的比例混合加入提取体系中，经过3天的发酵，铁皮石斛提取物中黄酮、多酚含量分别提升了118.20%和128.17%，·OH、DPPH、ABTS+的清除率也相应提高了43.03%、60.05%和94.87%。这表明混合菌发酵可有效提高铁皮石斛酚类物质的提取效率和体外抗氧化活性。

5 铁皮石斛在化妆品中的应用

近年来，基于化学合成品对人体皮肤可能存在的副作用，使用更安全、高效的天然生物提取成分在化妆品行业中已成为一种不可抵挡的趋势。现如今，越来越多的人将目光转移到铁皮石斛系列化妆品的开发应用，如保湿水、精华素等，这迎合了当下化妆品行业对“绿色、天然、无刺激”健康护肤理念的热切追求。

李晓娇等[47]以铁皮石斛为原料研发了一种面膜产品，其感官性能和理化质量均能符合QB/T2872-2017标准的规定。该面膜产品可达到77.20%保湿率和25%以上的DPPH清除率，具有保湿、抗氧化的功效，且使用感不黏腻、易涂抹吸收。程建华等[48]研发了一种含0.1%～10%铁皮石斛提取液的纳米纤维面膜，人体实验结果显示，该面膜能起到长效锁水保湿、抗皱、增强皮肤屏障等护肤功效。吴知情等[49]研发了一种含 10%～30%铁皮石斛提取物的中药组合物，具有清除·O2-和·OH的体外抗氧化活性；所调配的含5%该中药组合物的化妆品能有效增强人体皮肤锁水能力，起到滋养、舒缓、修复皮肤，改善肤质的效果。张珍林等[50]调配的一款以铁皮石斛花为原料的保湿柔肤水保湿效果好、性能稳定且作用温和。张卫星开发了以铁皮石斛提取物为主要功效成分的护肤产品具有抗氧化、补水保湿、增强皮肤屏障功能、美白等功效[51]。何辉麟研发的一种含1.25%铁皮石斛提取物的护肤喷雾组合物具有保湿、舒缓皮肤、改善肤质等功效，喷手腕可以实现经脉疏通，喷脸部可以达到紧致皮肤、抗衰老的效果[52]。陈超等研制了一款不添加任何刺激性成分的铁皮石斛修护水，其主要活性成分铁皮石斛茎提取物和β-葡聚糖协同作用发挥保湿、消炎、抗敏、止痒和修复皮肤屏障等多重功效，作用温和不伤肤[53]。