赵敏华，刘 吉，葛晨辉，徐晨曦，蔡晓锋，王小丽

（上海师范大学生命科学学院，上海 200234）

0 引言

菠菜（Spinacia oleraceaL.）属于苋科藜亚科菠菜属植物［1］，是世界性重要叶用蔬菜，具有很高的营养价值和经济价值.菠菜的生长需要充足的氮素供应，尤其是硝态氮，但过量硝态氮会导致菠菜硝酸盐积累，影响品质.生产上通常适当配施铵态氮以提高品质和产量，如SCHORTEMEYER等［2］发现，氮肥组合中铵态氮肥比例的增加，可显著降低硝酸盐和亚硝酸盐在菠菜体内的累积，提高菠菜茎叶中的氨基酸总量，同时获取最大的生物量.因此研究菠菜对铵态氮的吸收、转运及利用的机制，对于合理配施铵态氮肥，提高菠菜生产效能和品质有重要指导意义.

植物对铵态氮的吸收及体内转运都依赖铵态氮转运蛋白（AMT）.植物铵态氮转运蛋白家族属于AMT/MEP/Rh家族，主要由两个亚家族AMT1和AMT2构成［3］.为适应土壤中铵态氮供应浓度的变化，植物进化发展出低亲和转运系统（LATS）和高亲和转运系统（HATS），以充分吸收利用环境中的高、低铵态氮营养［4-6］.由于土壤中铵态氮含量较硝态氮低，植物铵态氮的吸收主要是由HATS构成.目前已经从拟南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、番茄（Solanum lycopersicum）等植物中鉴定到不同数目的AMT蛋白（表1），并对部分AMT功能开展了研究.此外，AMT不仅参与根部铵态氮的吸收运转，还参与地上部分铵态氮的运输和再分配、种子铵态氮的储存，以及铵态氮由共生菌向宿主植物的运输和根部发育等生理过程［7］.菠菜AMT研究尚未见系统报道.本文作者通过生物信息学方法筛选鉴定菠菜AMT编码基因，并研究其对不同氮素形态配比的响应模式，初步解析菠菜AMT基因家族在氮素响应中的功能.

表1 部分植物AMT1和AMT2家族成员数目表

1 材料与方法

1.1 材料处理

选取饱满一致的Sp75菠菜种子，经75%（体积分数）酒精消毒后，播种于吸满蒸馏水的工字孔育苗海绵中，待长出2片子叶后，选取长势一致的幼苗定植于10 L水培箱中.水培营养液采用1/2 Hoagland-Arnon配方.水培至两叶一心期开始氮处理实验.共设置7个氮处理，包括：①缺氮（不含氮）；②硝铵比7.0∶0.5（7.0 mmol·L-1NO3--N+0.5 mmol·L-1NH4+-N）；③硝铵比7.5∶0（7.5 mmol·L-1NO3--N）；④硝铵比0∶0.5（0.5 mmol·L-1NH4+-N）；⑤硝铵比0∶7.5（7.5 mmol·L-1NH4+-N）；⑥硝铵比0.25∶0（0.25 mmol·L-1NO3--N）；⑦正常1/2 Hoagland-Arnon配方处理，硝铵比为7.0∶0.5.处理②～⑦前，均先缺氮预处理2 d.每个处理均设置3次重复.采用CaCl2，K2SO4，KH2PO4调节不同处理中Ca，K，P的浓度，使它们保持一致，其余营养由MgSO4·7H2O，NaFeEDTA，及Amon微量元素配方提供.调节水培营养液pH值为6.0±0.2.处理全程在人工气候室中完成，温度为20℃/18℃（光照/黑暗），光周期为10 h/14 h（光照/黑暗），湿度控制在68%左右.分别于氮素处理0，0.5，2，24，48 h后取样，-80℃保存，用于氮素响应表达谱分析.同时采集正常供氮（1/2 Hoagland-Arnon）培养1周的幼苗叶片、叶柄及根样品，-80℃保存，用于组织表达谱分析.

1.2 菠菜AMT基因家族成员的鉴定

将拟南芥AMT蛋白序列在菠菜基因组数据库（www.spinachbase.org）中进行同源比对搜索，并根据菠菜基因组注释结果，剔除重复序列后获得菠菜AMT候选序列.利用NCBI CDD在线工具（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）预测AMT结构域，存在完整AMT结构域的，则认定为菠菜AMT家族候选蛋白.利用ExPaSy（http：//web.expasy.org/protparam）预测候选蛋白各项理化性质，包括氨基酸数量、相对分子质量、等电点、脂溶系数等.利用WoLF PSORT（http：//wolfpsort.hgc.jp/）和TMHMM Server 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分别对候选蛋白进行亚细胞定位和跨膜结构的预测.

1.3 基因结构、保守结构域及进化分析

基因结构使用TBtools工具进行分析，并进行可视化操作［23］.利用MEME Suite（http：//meme.sdsc.edu/meme/memeintro.html/）进行蛋白质保守基序（motif）分析，最大保守序列鉴定数目设置为10，TBtools工具进行基序模式可视化.利用MEGA-X软件，采用邻接（NJ）法构建菠菜AMT基因家族进化树及其与多物种之间的系统进化树，校验参数bootstrap设置为1 000，其余均为默认参数.同时选取基因家族起始密码子上游2 000 bp启动子片段，利用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）进行顺式作用元件分析，用TBtools工具可视化.

1.4 基因表达谱分析

采用Trizol法提取菠菜总核糖核酸（RNA），通过PrimeScript™RT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara）试剂盒将提取的总RNA反转录成cDNA（complementary DNA）.使用Primer Premier 5进行实时荧光定量-聚合酶链式反应（qRT-PCR）引物设计（表2），Tm值控制在57～61℃.最后使用TaKaRa TB Green TM Premix Ex Taq TM（Tli RNaseH Plus）试剂盒在Applied Biosystems 7500 Real Time PCR仪器上进行qRT-PCR反应.采用18s rRNA作为内参，以2-ΔΔCT法计算基因的相对表达量，用Sigma Plot 7.0对结果进行作图.采用TBtools工具绘制基因表达量热图，数据作log2转换后以行为单位均一化，采用Euclidean法聚类.

表2 实验所用引物设计

2 结果与分析

2.1 菠菜SoAMT基因家族成员鉴定

在菠菜Sp75基因组数据库（2018），Monoe-Viroflay基因组库（2021）中共获得同源性较高的候选蛋白序列6条，其中5个候选蛋白在两个基因组数据库中完全相同，只有SoAMT1A（Spo21031）仅在Sp75基因组数据库（2018）中被鉴定到（表3）.使用在线网站NCBI CCD-search进行逐条验证，结果显示：5个候选蛋白包含amt保守结构域，1个候选蛋白包含AmtB结构域.序列分析表明，6个SoAMT基因分布在4条染色体上（第1，4，5，6条染色体），编码区（CDS）长度在1 443～1 506 bp之间，编码的6个AMT蛋白氨基酸数目为462～501个，其中SoAMT1B、SoAMT1D包含501个氨基酸；而SoAMT2氨基酸数目最少（480个）.候选蛋白的分子质量和等电点范围分别为377.829～632.678 ku和5.59～7.64.SoAMT1A预测的等电点最低（5.59），SoAMT1B预测的等电点最高（7.64）；6个SoAMT蛋白的平均亲水系数均为正值，表明它们均为疏水性蛋白.SoAMT蛋白的亚细胞定位预测结果均显示定位于质膜上，且含有9～11个跨膜结构域.

表3 菠菜SoAMTs基因家族基因数据库信息

2.2 AMT进化树、保守基序及基因结构分析

对拟南芥（6个）、黄瓜（5个）、大豆（9个）、苜蓿（7个）、水稻（3个）、玉米（8个）、百脉根（5个）及菠菜（6个）共49个AMT蛋白序列进行系统进化树分析，结果如图1所示.49个AMT蛋白聚成两类：AMT1亚家族和AMT2亚家族.菠菜SoAMT2（Spo20483）与拟南芥、苜蓿、百脉根等分组到AMT2亚家族的分支上，其余5个菠菜AMT与其他物种均属于AMT1亚家族分支.

图1 菠菜与其他植物AMT进化树分析.

菠菜AMT家族基因编码蛋白的序列分析表明，除SoAMT2（Spo20483）外，菠菜AMT基因具有类似的编码区和核苷酸长度，如图2（a）所示，但不同基因间，内含子数差异较大，SoAMT1C（Spo24676），SoAMT1B（Spo24677）不含有内含子，SoAMT2（Spo20483）含有2个内含子，其余3个菠菜AMT基因含有1个内含子.SoAMT2与其余5个SoAMT1蛋白保守基序有较大差异，在SoAMT1结构域内鉴定到10个Motif，而SoAMT2只 有4个Motif，如 图2（b）所示.6个SoAMT蛋白均具有共同的Motif 6，如图2（c）所 示，尤其是Motif 6中 的DFAGSGVVHLVGGIAGLWGSIIEGPR（SoAMT1亚家族）和DYSGGYVIHV SSGIAGFTAAYWVGPR（SoAMT2亚家族），与已报道的AMT保守基序D-［FYWS］-［AS］-G-［GSC］-x（2）-［IV］-x（3）-［SAG］（2）-x（2）-［SAG］-［LIVMF］-x（3）-［LIVMFYWA］（2）-x-［GK］-x-R［24］，以及D204FAGSGMVHMVGGIAGLWGAFIESPR229［25］一致.

图2 菠菜SoAMT家族的（a）基因结构、（b）保守基序、（c）Motif

3.3 SoAMT基因家族顺式作用元件分析

SoAMT启动子区顺式调控元件分析发现，除了典型的核心启动子TATA-Box外，这些序列还具有光响应、无氧响应以及胁迫相关的顺式元件，包括缺氧胁迫元件（ARE）、ABA响应元件（ABA，ABRE）、生长素响应元件（Auxin，TGA-element/AuxRE）、干旱诱导元件（Drought，MBS）、茉莉酸甲酯响应元件（MeJA，CGTCA-motif）、水杨酸响应元件（SA，TCA-element）以及赤霉素响应元件（GA，TATC-box）等（图3）.不同成员顺式作用元件数目和种类存在差异，SoAMT1A（Spo21031）含有较多ABA响应元件，SoAMT1B（Spo24677）不含有茉莉酸甲酯响应元件，而其余成员均有该元件.SoAMT2（Spo20483）含有的ARE响应元件数量明显多于SoAMT1亚家族成员.

图3 SoAMTs顺式作用元件分析

2.4 AMT基因的组织表达分析

SoAMT基因在菠菜不同组织部位中的表达有差异，如图4所示：SoAMT1A（Spo21031），SoAMT1B（Spo24677），SoAMT1D（Spo05791）在地上部分的表达量明显高于根的，而SoAMT1C（Spo24676）在根中表达量较高，SoAMT1E（Spo16971）在叶柄中表达量明显低于叶片和根.SoAMT2（Spo20483）在根和柄中的表达量明显高于叶片的.供试6个SoAMT基因中，SoAMT1C在叶片、柄及根中的表达量均显著高于其他AMT基因.

图4 SoAMT基因组织表达量分析.注：柱头不同小写字母表示同一基因组织间差异显著，下同

2.5 SoAMT基因响应氮源供应的表达分析

缺氮处理对不同SoAMT基因表达量影响不同（图5）.除SoAMT1D（Spo05791）表达量受缺氮处理影响不显著外，随着处理时间的延长，其余4个SoAMT1表达模式基本呈上调趋势.SoAMT1E（Spo16971），SoAMT1C（Spo24676）及SoAMT1B（Spo24677）表达量变化趋势相似，随处理时间延长，表达量增加，缺氮处理48 h时表达量最大，分别为对照的12.76，8.36，15.04倍，受长期缺氮处理的诱导影响显著.SoAMT1A（Spo21031）表达量在处理0.5 h时无显著变化，处理2，24，48 h时显著上调，平均为对照的4.46倍.

图5 缺氮处理下SoAMT基因表达谱

与SoAMT1表达模式不同，随着处理时间的延长，SoAMT2（Spo20483）表达量先增加后下降，处理24 h 时与对照组（7.5 mmol·L-1NO3--N+0.5 mmol·L-1NH4+-N）差异不大，48 h时甚至低于正常供氮对照组.

以缺氮处理为对照，考察SoAMT基因对不同铵态氮浓度的响应，结果如图6～7所示，单独供应铵态氮时，5个SoAMT1表达量均在处理0.5～24 h后无显著变化，48 h后表达量上调；其中SoAMT1A（Spo21031）和SoAMT1B（Spo24677）表达量在高浓度铵态氮（7.5 mmol·L-1）与低浓度铵态氮（0.5 mmol·L-1）处理下无显著差异.不同的是，SoAMT1D（Spo05791）和SoAMT1C（Spo24676）表达量显著受低铵态氮诱导，而SoAMT1E（Spo16971）表达量显著受高铵态氮诱导.单独铵态氮供应下，SoAMT2表达量变化趋势与SoAMT1正好相反，其表达量受铵态氮抑制，供试时间内表达量均低于缺氮对照组.

图6 不同铵态氮浓度处理下菠菜根SoAMT基因表达谱.

实验同时比较了不同硝态氮浓度及铵硝配比对SoAMT基因表达量的影响（图7～8），结果发现，单独供应硝态氮也能不同程度地诱导SoAMT1基因的表达，SoAMT1A（Spo21031）对高低硝态氮浓度响应差异不显著，处理48 h时表达量达到峰值；SoAMT1D（Spo05791）和SoAMT1B（Spo24677）表达量分别在低硝态氮处理0.5 h和高硝态氮处理48 h时显著上调，其余处理时间下变化不大.SoAMT1C（Spo24676）和SoAMT1E（Spo16971）在低硝态氮处理0.5，2，48 h后的表达量均显著高于缺氮对照，且在48 h时表达量达到最高.硝铵物质的量浓度配比为7.0∶0.5时，不同SoAMT1基因表达模式不同，如SoAMT1B基因在硝铵混合处理48 h时，表达量达到最大值，与其在高硝处理下的表达谱更相似；硝铵混合处理下的SoAMT1D的表达谱与低铵态氮处理相似，48 h达到峰值，而SoAMT1E的硝铵混合氮响应表达谱与其在低硝态氮处理更相似，均在2 h和48 h有明显的上调.SoAMT2氮响应表达模式与SoAMT1不同，除高硝态氮处理48 h后，其表达量显著上调外，其余氮处理均抑制了SoAMT2的表达.硝铵混合处理下，SoAMT2表达同样受到抑制，低于缺氮对照组.

图7 不同氮处理条件下SoAMT基因表达谱比较.

综上，缺氮（除SoAMT1D外）、铵态氮及硝态氮供应均能不同程度地提高5个SoAMT1基因的表达量，大部分基因在48 h时表达量达到峰值；铵态氮或硝态氮供应对SoAMT1A（Spo21031）的表达的作用不受供氮浓度的影响；低氮（铵态氮或硝态氮）显著诱导SoAMT1C（Spo24676）和SoAMT1D（Spo05791）的表达，而SoAMT1E（Spo16971）仅受高铵和低硝显著诱导；高浓度硝态氮诱导SoAMT1B（Spo24677）表达，而铵态氮浓度对其影响差异不大.与SoAMT1相反，SoAMT2基因表达量仅受短期缺氮和长期高浓度硝态氮诱导，在铵态氮存在或低硝态氮浓度处理下，其表达量受抑制.

图8 不同硝铵浓度处理下菠菜根SoAMT基因表达谱.

3 讨论

本文作者在菠菜基因组数据中共鉴定得到6个AMT家族基因，其数量与已报道的作物，如拟南芥（6个）、番茄（4个）、菜苔（5个），黄瓜（6个）等植物AMT数目大致相近，说明菠菜AMT家族基因不存在明显的基因重复和缩减现象，AMT家族数目保守性较高.同源系统进化分析表明，SoAMT分属AMT1和AMT2两个亚家族，且AMT2成员只有1个.与水稻、杨树、大豆等作物具有较多AMT2成员相比，菠菜AMT2成员数量明显少于AMT1，不同植物中AMT1和AMT2成员数目的不同可能与其氮素吸收偏好、真菌共生及生长环境有关，喜铵（水稻、杨树）、固氮（大豆）等作物通常具有更多的AMT2［22，26］.

与其他物种（如玉米、拟南芥、水稻等）AMT蛋白相比，SoAMT蛋白在结构上与其高度相似，具有与拟南芥、番茄等类似的编码区和核苷酸长度，含有AMT蛋白典型的保守结构和保守基序，外显子-内含子结构也与其他许多植物物种的分析结果相类似［4］，证明了AMT蛋白结构和基因组成的保守性.顺式作用元件分析显示，SoAMT可能参与多个激素及逆境途径的调控，其生物学功能可能不仅局限于铵态氮的吸收与运转，还参与逆境胁迫的响应途径等.

拟南芥AMT1亚家族主要存在于根部，而AMT2亚家族则广泛分布于植物主要器官中［6］.菠菜SoAMT基因的组织表达谱具有特异性，除SoAMT1D在根中表达量很低外，其余在根和地上部分中均有较高表达，与其他植物的组织表达谱存在差异，可能与其独特的生物学功能相关.

已有研究表明，AMT转录水平受植物氮浓度及氮素形式的影响，在缺氮条件下大多数AMT基因的表达会受到缺氮诱导而大幅提高［9］，这与本实验中SoAMT基因受缺氮胁迫诱导后表达上调结果一致.缺氮一周后恢复供氮，不同浓度的铵态氮、硝态氮处理条件下各基因表达谱有差异.SoAMT1A在根、叶、柄中均有较高表达量，其根部表达量受缺氮诱导，但对铵态氮、硝态氮浓度的变化响应差异不明显，与拟南芥、水稻等模式植物的AMT基因同源性较小，推测SoAMT1A可能是一个组成型铵态氮转运蛋白，或者不参与氮素的转运，具体结论还有待进一步研究证实.

SoAMT1B和SoAMT1C序列同源性较高，均在根、叶、柄中具有较高的表达量，根中表达量均受缺氮和高浓度硝态氮的诱导.不同的是，SoAMT1B对铵态氮浓度不敏感，在长期高浓度和低浓度的铵态氮作用下均被诱导上调；而SoAMT1C受低浓度的铵态氮诱导，在烟草NtAMT1.3中也发现类似氮响应表达谱，氮饥饿和供应NH4+、硝酸盐的条件下，NtAMT1.3表达显著上调，且NtAMT1.3过表达促进了植株根对NH4+的吸收，及叶片氮素的积累，本文作者推测NtAMT1.3在烟草NH4+的获取和利用中发挥着重要作用［27］.因此，SoAMT1B和SoAMT1C可能也具有类似的铵态氮吸收运转功能，结合菠菜组织表达谱，SoAMT1B更可能参与菠菜地上部分铵态氮的转运，尤其是在硝态氮供应充足条件下（其表达水平受高硝诱导），负责地上部分硝态氮还原产物的转运和分配；SoAMT1C在根组织中表达水平最高，更可能是一个根部的铵态氮吸收转运蛋白，根据进化树分析结果，SoAMT1C与AtAMT1.2也具有较高的同源性.已知AtAMT1.2转录水平也受缺氮诱导，是一个高亲和转运蛋白，负责根质外体中铵态氮向内皮层细胞的转运过程［9］，推测SoAMT1C可能在菠菜根部铵态氮高亲和吸收中发挥重要作用.更重要的是，供应不同浓度的硝态氮以及硝铵比7.0∶0.5混施处理，也能上调SoAMT1C的表达量，但表达水平不如低铵态氮处理下高，进一步说明SoAMT1C可能在高亲和铵态氮转运中发挥功能，并在一定程度上受硝态氮供应的影响.SoAMT1C在硝铵互作中的功能值得进一步深入研究.

与大部分SoAMT表达受缺氮诱导不同，SoAMT1D不受缺氮诱导，且根中表达量为6个SoAMT中最低的.尽管在进化树上看，SoAMT1D与AtAMT1.1，AtAMT1.3具有较高的同源性，但AtAMT1.1和AtAMT1.3均受缺氮诱导，是拟南芥高亲和铵态氮吸收的主要贡献者［9，28］.表达谱的差异说明SoAMT1D与AtAMT1.1，AtAMT1.3在功能上差异很大，考虑到SoAMT1D可被低浓度铵态氮诱导，且在地上部分具有较高的表达水平，推测其负责地上部分铵态氮的高亲和转运.

SoAMT1E表达受缺氮和高浓度铵态氮诱导，这与水稻OsAMT1.1相似，OsAMT1.1受缺氮、供氮均诱导，高铵条件下表达量大于缺氮处理.已知OsAMT1.1是一个双亲和铵态氮转运蛋白，负责铵态氮由根向地上部分的转运，过表达OsAMT1.1能提高地上部分铵态氮含量，和籽粒产量的增加［21，29-30］.同源进化树结果显示，SoAMT1E与AtAMT1.4也具有较高的同源性.AtAMT1.4是拟南芥花粉中特异表达的转运蛋白［31］，在根、叶等组织器官中未见表达，SoAMT1E与AtAMT1.4的组织表达谱差异较大，不太可能具有类似的生物学功能，更可能与OsAMT1.1相似.

SoAMT2是供试6个SoAMT中唯一受高浓度和低浓度铵态氮抑制的AMT成员，其表达谱与棉花GhAMT1.3和AtAMT2.1相似，均受缺氮诱导和较高铵态氮浓度（＞1 mmol·L-1NH4+）抑制［8，32］.功能实验证明，GhAMT1.3是一个高亲和铵态氮吸收转运蛋白，在棉花铵态氮吸收和利用中起重要作用，而AtAMT2.1受较高铵态氮（1 mmol·L-1或10 mmol·L-1）抑制，却是一个低亲和铵态氮转运蛋白.本研究中，SoAMT2的转录水平受低浓度（0.5 mmol·L-1）和高浓度（7.5 mmol·L-1）铵态氮的抑制，其在铵态氮转运中的功能未知，或许是一个双亲和蛋白，参与调节植物体内铵态氮的动态平衡.

由上可知，SoAMT基因表达水平不仅受外源铵态氮浓度的影响，部分SoAMT表达谱还受硝态氮浓度的影响，如SoAMT1C，SoAMT1D，SoAMT1E显著受单一低硝态氮浓度的诱导，而SoAMT2表达量在长期单一高浓度硝态氮处理下表现上调.有关SoAMT受外源硝态氮浓度的影响，可能的解释有：一方面，硝态氮不仅是植物氮素来源，还作为信号分子，调控植物氮响应途径，从而参与铵态氮转运蛋白的转录调控；另一方面，铵态氮是植物体内硝态氮的还原产物，外源硝态氮的供应必然影响植物体内铵态氮库的大小［17，33］，从而影响相关基因的表达.SoAMT的表达谱还与两种氮素形式是否混合供氮有关，如SoAMT1D在低浓度铵态氮下的表达谱与硝铵混合处理相似，说明低浓度铵态氮对SoAMT1D的诱导作用不受高浓度硝态氮的影响，高浓度硝态氮对SoAMT1B（Spo24677）表达量的诱导又与营养液中是否添加铵态氮无关，相反，硝铵混合处理下SoAMT1C的表达谱与单一硝态氮或铵态氮差异很大，说明SoAMT成员间在菠菜硝铵互作中的作用不同，值得更一步深入研究.

4 结论

本文作者从菠菜基因组数据库中共鉴定到6个SoAMT基因家族蛋白，包括5个AMT1亚家族成员和1个AMT2亚家族成员.菠菜SoAMT与其他植物AMT蛋白结构相似，高度保守，但在组织表达谱和氮响应表达谱上与其他物种同源基因差异较大.根据其不同的氮响应模式，初步推测了其在铵态氮吸收转运中的功能，可为后续进一步深入研究奠定基础.