王芝超，左 丽，旷年玲，邓聪聪，钟翠红,2，林冬梅,2，张永英,2

(1. 河北工程大学生命科学与食品工程学院，河北 邯郸 056000 ； 2. 河北省禽病工程技术研究中心，河北 邯郸 056000)

近年来多重耐药大肠杆菌的出现和广泛传播，给疾病治疗带来了巨大困难[1]，致使抗菌药物治疗效果越来越差。大肠杆菌耐药性由多重耐药机制决定[2]，大肠杆菌R质粒携带多种耐药基因，使细菌对某些抗菌药耐药[3]；β-内酰胺类耐药大肠杆菌可水解其中β-内酰胺环，导致抗菌药敏感性降低[4]；大肠杆菌主动外排系统将进入细胞内的药物转运至细胞外，使胞内药物浓度下降，逃避药物杀伤作用；大肠杆菌耐药率与生物膜形成能力成正比[5]。而中药成分复杂，一种中药含有多种有效成分，具有多靶位效应，对于不同耐药机制介导的大肠杆菌耐药性消除较单一成分更具有实际应用价值。

黄连具有清热、燥湿和排毒等功效，具有广泛药理活性。研究表明，小檗碱为黄连中最重要的活性单体，其抗菌能力强，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、猪链球菌等具有明显抑制作用[6]。宁官保等[7]研究发现，大肠杆菌经黄连提取液作用后缺失2条质粒条带。吴峥嵘[8]研究表明，将高、中、低浓度双黄连分别作用于多重耐药大肠杆菌时，β-内酰胺酶活性由初始(9.52±0.71) U/mg分别降至(3.81±0.36) U/mg、(7.54±0.49) U/mg、(9.08±0.61) U/mg，并且当双黄连作用耐药菌24 h时，大肠杆菌细胞膜结构被完全破坏，出现细胞质流失。但尚未发现有关黄连对大肠杆菌4种耐药机制消除情况的研究，因此本试验根据中药消除耐药大肠杆菌耐药机制，检测经黄连作用后耐药大肠杆菌R质粒携带情况、超广谱β-内酰胺酶(Extended spectrum beta-lactamases，ESBLs)活性、主动外排泵基因acrA、acrBmRNA相对表达量及生物膜粘附性情况，为临床筛选新抑制剂提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验药物、试剂及菌株 黄连，购自邯郸同仁堂药房；质粒提取试剂盒、RNA提取试剂盒、荧光定量PCR试剂盒，均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。4株对β-内酰胺类药物耐药的大肠杆菌(命名为E-1～E-4)，由河北工程大学禽病工程技术研究中心保存。

1.2 中药水提物制备 黄连100 g，浸泡30 min，文火熬制2次，合并浓缩，过滤除菌，浓度以生药计(1 g/mL)。

1.3 中药水提物最低抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration，MIC)测定 采用梯度稀释法，中药水提物2倍倍比稀释，共设10个梯度，第1～10孔加入浓度为1×106CFU/mL菌液100 μL，第11孔只加入100 μL菌液作为阳性对照，第12孔加入100 μL LB液体培养基作为阴性对照，混匀，37 ℃培养24 h，观察结果，无菌生长的最低稀释度即定为MIC值。

1.4 中药水提物处理菌液制备 浓度为1×106CFU/mL菌液中加入终浓度为1/2 MIC的中药水提物，37 ℃摇床培养18～24 h后，将此菌液重新接种至LB液体培养基中，37 ℃摇床培养4.0～4.5 h。

1.5 大肠杆菌R质粒消除试验 按照试剂盒说明书操作步骤提取细菌质粒，1%琼脂糖凝胶电泳检测对照组(未经黄连水提物处理的菌株)和黄连组(经黄连水提物处理的菌株)R质粒携带情况。

1.6 大肠杆菌ESBLs活性试验 采用双纸片法头孢噻肟(CTX)和头孢噻肟/克拉维酸(CTX/CA)、头孢他啶(CAZ)和头孢他啶/克拉维酸(CAZ/CA)测定对照组和黄连组大肠杆菌ESBLs活性变化。结果判定：参照美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)双纸片确认方法[9]，若含酶抑制剂纸片抑菌圈直径-单药纸片抑菌圈直径≥5 mm，判为ESBLs阳性。

1.7 大肠杆菌主动外排基因acrA和acrBmRNA表达 按照试剂盒说明书对菌株进行RNA抽提、反转录合成cDNA，利用荧光定量PCR法检测对照组和黄连组外排系统基因acrA、acrBmRNA的相对表达量。具体反应条件见表1，利用2-△△Ct法参照参考文献[10]对荧光定量PCR的数据进行相对定量分析。

表1 大肠杆菌基因引物信息和荧光定量PCR反应条件Table 1 E.coli gene primer details and qPCR reaction conditions

1.8 大肠杆菌生物膜试验 采用生物膜阳性筛选方法，在96孔板中分别加入对照组菌液(OD600 nm0.4～0.6)、黄连组菌液和LB液体培养基(空白组)每孔200 μL，每组5个重复，37 ℃培养36～48 h，再经1%PBS清洗、甲醇固定、1%结晶紫染色、33%冰醋酸溶液脱色后，酶标仪测定OD600 nm值。计算和结果判定参照参考文献[11]：测定值-空白值>0.12判为生物膜阳性，临界值(AC):空白组平均OD值+3×标准差；不粘附(-)OD4AC。

1.9 统计学分析 使用SPSS软件进行统计学分析，2个组均数比较用t检验，P<0.05为差异显著，具有统计学意义。

2 结果

2.1 中药水提物MIC测定 如表2所示，黄连对4株大肠杆菌均有不同程度抑菌效果，其MIC在0.03～0.06 g/mL。

2.2 大肠杆菌R质粒消除试验 4株大肠杆菌均携带3个质粒条带，经黄连作用后均表现1～3个质粒条带消除(图1)。

表2 中药水提物对4株大肠杆菌MIC值Table 2 MIC value of traditional Chinese medicine liquid on 4 E.coli strains (g/mL)

图1 大肠杆菌质粒电泳图谱Fig.1 Electrophoretic map of E.coli plasmidsM：1kb DNA ladder Marker； E-1、E-2、E-3、E-4：对照组； E-1a、E-2a、E-3a、E-4a：黄连组M:1kb DNA ladder Marker; E-1，E-2，E-3,E-4：Control group； E-1a,E-2a,E-3a,E-4a：Rhizoma Coptidis group

2.3 大肠杆菌ESBLs活性试验 如表3所示，对照组E-1、E-3含酶抑制剂纸片(CTX/CA、CAZ/CA)抑菌圈直径-单药纸片(CTX、CAZ)抑菌圈直径<5 mm，判定为产ESBLs阴性菌；对照组E-2、E-4含酶抑制剂纸片(CTX/CA、CAZ/CA)抑菌圈直径-单药纸片(CTX、CAZ)抑菌圈直径≥5 mm，判定为产ESBLs阳性菌；黄连组E-2、E-4 CAZ和CAZ/CA、CTX和CTX/CA药敏纸片与对照组相比抑菌圈直径增大，且差异显著(P<0.05)，说明黄连可抑制ESBLs活性。

表3 CTX和CTX/CA、CAZ和CAZ/CA对E-1、E-2、E-3、E-4的抑菌圈直径Table 3 Inhibitory zone diameters of CTX and CTX/CA、CAZ and CAZ/CA to E-1,E-2，E-3,E-4 (mm)

2.4 大肠杆菌主动外排基因acrA和acrBmRNA表达 如图2所示，与对照组相比，黄连组4株大肠杆菌acrAmRNA相对表达量均下降，且差异显著(P<0.05)；黄连组E-1acrBmRNA相对表达量下降，但差异不显著(P>0.05)，E-2、E-3、E-4acrBmRNA相对表达量均下降，且差异显著(P<0.05)。说明中药黄连可降低鸡源大肠杆菌外排泵基因acrA和acrBmRNA表达量，从而降低外排泵基因表达量，达到消除耐药目的。

图2 外排泵基因mRNA相对表达量(2-△△Ct)Fig.2 Relative mRNA expression levels of efflux pump gene (2-△△Ct)A：4株大肠杆菌acrA mRNA相对表达量； B：4株大肠杆菌acrB mRNA相对表达量A:Relative expression of acrA mRNA of 4 E.coli strains; B:Relative expression of acrB mRNA of 4 E.coli strains

2.5 大肠杆菌生物膜试验 结果见图3，4株鸡源大肠杆菌中E-1测定值-空白值<0.12，判定为生物膜阴性菌；E-2、E-3、E-4测定值-空白值>0.12，判定为生物膜阳性菌；与对照组相比，黄连组E-2、E-4粘附性由中等粘附性(++)变为弱粘附性(+)；E3由强粘附性(+++)变为弱粘附性(+)。

图3 4株大肠杆菌生物膜粘附性分析Fig.3 Biofilm adhesion analysis of 4 E.coli strains

3 讨论

大肠杆菌R质粒携带多种耐药基因，使细菌对某些抗菌药耐药。研究表明，中药可有效消除大肠杆菌R质粒，且在疾病治疗中发挥重要作用。刘洋[12]研究表明，山楂水提物作用于8株β-内酰胺类药物耐药大肠杆菌后，其质粒条带均缺失1～3条，耐药消除率达20%以上。杨奇等[13]研究发现，黄连作用于多重耐药大肠杆菌后，均有部分质粒条带缺失，其耐药消除率达4.8%，黄连中小檗碱可以抑制多重耐药大肠杆菌细胞膜蛋白合成。

耐药大肠杆菌产生β-内酰胺酶，可使抗菌药丧失活性。Shrivastav等[14]研究发现，丁香油和罗勒叶对β-内酰胺酶具有很好的抑制能力，并且2种中药协同使用效果更佳。曹敏[15]研究表明，芦荟大黄素、木犀草素、苦参碱、黄连素、香紫苏醇均能抑制β-内酰胺酶活性。本试验中，黄连组E-2、E-4 CAZ和CAZ/CA、CTX和CTX/CA药敏纸片与对照组相比抑菌圈直径增大，说明黄连可抑制ESBLs活性，增强大肠杆菌对抗菌药的敏感性，这一结果与吴峥嵘[16]研究结果相吻合。马驰[17]研究发现，由黄连组成的双黄连方剂不仅可以消除多重耐药大肠杆菌R质粒，还可以抑制β-内酰胺酶活性。

主动外排系统(AcrAB-TolC)是大肠杆菌产生对β-内酰胺类药物耐药性重要机制之一，该系统将进入细胞内的药物转运至细胞外，使胞内药物浓度下降，从而逃避药物的杀伤作用达到自我保护的目的。刘坤友等[18]研究表明，苦丁茶处理后的耐药大肠杆菌，主动外排系统中acrAmRNA表达量由5.01下降至1.77；经小飞扬草处理后的耐药大肠杆菌，acrAmRNA相对表达量由1.57降至0.32。任玲玲[19]研究发现，小檗属类植物中黄连可有效抑制主动外排泵活性，由黄连组成的方剂“连黄”，可使耐药大肠杆菌的外排泵基因acrAmRNA表达量下降，这与本试验结果相同。本试验中经黄连处理后耐药大肠杆菌的外排泵基因acrA和acrBmRNA相对表达量显著下降，说明黄连可以降低外排泵基因表达量，使细胞转运能力下降，减少抗菌药物流出，从而增强大肠杆菌的抗菌药物敏感性，降低或消除大肠杆菌耐药性。

大肠杆菌耐药率与生物膜形成能力成正比，中药对具有强生物膜形成能力菌株表现出明显的抑制作用，这为消除大肠杆菌耐药性提供了基础。Qu等[20]研究表明，多重耐药大肠杆菌经槲皮素处理后，其β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶水平显著升高，大肠杆菌细胞外膜破裂。张玉国[21]研究发现，黄连连续作用四环素类药物耐药大肠杆菌后，菌株外膜蛋白OmpF和OmpC由缺失变为恢复表达，使耐药大肠杆菌外膜粘附性下降，与本试验结果相同。本试验中E-1为生物膜阴性菌，黄连组E-2、E-4的粘附性由中等粘附性(++)变为弱粘附性(+)；而E-3由强粘附性(+++)变为弱粘附性(+)，说明黄连可使耐药大肠杆菌外膜粘附性下降，形成生物膜的能力降低或消失，从而达到消除耐药性目的。

综上所述，黄连不仅能消除β-内酰胺类药物耐药大肠杆菌的R质粒、抑制ESBLs活性和生物膜的形成，还可以降低主动外排泵基因acrA和acrBmRNA表达量。总之，黄连对不同耐药机制介导的大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药均具有消除作用。