郑丹，彭雯鑫，毛慧淇，沈红兰，周学，张玉千

（南京师范大学泰州学院 化学与生物工程学院，江苏泰州 225300）

5,7,8,4’-四羟基异黄酮固体呈微黄色，属于异黄酮类物质，是染料木素的羟基化衍生物。染料木素是一种雌激素样化合物，被称为植物雌激素类药物，医药行业主要用于治疗妇科疾病和老年性骨质疏松症[1]，在抗肿瘤[2]、抗炎、镇痛、降尿酸[3]、降血脂[4]、体外抗肝纤维化[5]等方面也具有明显的生物活性。染料木素在人体肠道中吸收，在细胞内经羟基化生成5,7,8,4’-四羟基异黄酮等代谢产物[6]。5,7,8,4’-四羟基异黄酮是酪氨酸酶的有效抑制剂，具有较强的酪氨酸酶抑制活性[7]，在皮肤色素疾病的治疗、食品保鲜及农业抗虫领域应用广泛[8]。5,7,8,4'- 四羟基异黄酮结构见图1。

图1 5,7,8,4’-四羟基异黄酮结构

现有的研究大多从大豆制品中提取分离获得5,7,8,4’-四羟基异黄酮，如CHANG[9]利用黑曲霉从500 g大豆胚芽固体曲中提取得到了33.5 mg的5,7,8,4’-四羟基异黄酮，收率仅为0.006 7%，且纯度未报道。槐角富含黄酮类化合物，经过棘孢曲霉的发酵转化后，染料木苷和槐角苷等苷类物质能被转化为5,7,8,4’-四羟基异黄酮[10-11]。

高效制备液相色谱具有良好的分离度、灵敏度及较大的样品通量，是现阶段天然产物研究中不可或缺的重要工具[12]。如王大力等[13]利用反相高效液相色谱法从洋葱中分离得到两个黄酮类化合物，彭金咏等[14]利用反相制备液相色谱分离白花败酱草异戊烯基黄酮。

本研究以棘孢曲霉转化槐角原料，利用半制备液相色谱分离纯化5,7,8,4’-四羟基异黄酮，对流动相比例、流速等色谱条件进行了优化，为从槐角中制备高纯度的5,7,8,4’-四羟基异黄酮提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与培养基

槐角粉（80目），市售；棘孢曲霉（CCTCC M 2011264）由本实验室筛选。

PDA斜面培养基：土豆200 g、蔗糖20 g、琼脂18 g，定容至1 L，pH自然。

发酵培养基：10%槐角水提液，pH自然。

乙睛、甲醇，HPLC级，德国默克公司；乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、磷酸，分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

CA-1390-1垂直层流洁净工作台，上海上净净化设备有限公司；Agilent 6460三重串联四极杆液质联用仪，美国Agilent公司；GNP-9080隔水式恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；HD-930型组合式恒温摇床，太仓市博莱特实验仪器厂；Nexus670型傅立叶变换红外光谱仪，美国Thermo Nicolet公司；ES-315高压蒸汽灭菌锅，日本TOMY公司；FA1004电子分析天平，上海天平仪器技术有限公司；Agilent 1260型高效液相色谱仪，美国Agilent公司；AVANCE NEO 400M核磁共振仪，德国Bruker公司；Agilent 1200半制备型高效液相色谱仪，美国Agilent公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品的制备

将保藏菌种转接至PDA斜面活化，30 ℃培养3 d。向斜面中加10 mL蒸馏水做成孢子悬液，按10%的接种量转接至发酵培养基，30 ℃、160 r/min摇床振荡培养72 h。取出发酵液8 000 r/min离心15 min，取上清，用等体积乙酸乙酯萃取。萃取液真空浓缩至干，甲醇重新溶解，用制备液相收集5,7,8,4’-四羟基异黄酮，用分析型高效液相色谱仪检测分析，冷冻干燥得到固体产品。

1.3.2 色谱条件

分析液相条件：C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相A为0.07%磷酸水溶液，流动相B为甲醇-乙腈（12∶30，V∶V）；洗脱程序为0～12 min 32%B，12～20 min 54%B；紫外检测器波长为260 nm；流速为1 mL/min；进样量为2 μL；柱温为25 ℃。

制备液相条件：AQ-C18色谱柱（22 mm×250 mm，5 μm）；流动相A为0.07%磷酸水溶液，流动相B为甲醇-乙腈（12∶30，V∶V），55%B线性洗脱；流速7 mL/min；进样量2 mL；紫外检测器波长260 nm；柱温为室温。

1.3.3 产物的结构鉴定

分别用化学显色反应、液质联用（LC-MS）与红外检测（IR）、核磁（NMR）对转化产物进行结构分析。

（1）化学显色法。将样品溶于1.0 mL甲醇或乙醇中，加入少许镁粉（或锌粉）振摇，滴加4～5滴浓盐酸，2～3 min内（必要时微热）即可显色，对照组仅加浓盐酸。

（2）LC-MS法。ESI离子源，采用正、负离子模式，氮气为干燥气体（流速7.0 L/min，330 ℃），喷射器压力为 5 psi。

（3）IR法。扫描范围4 000～400 cm-1，溴化钾压片法。

（4）NMR法。溶剂为DMSO-d6。

2 结果与分析

2.1 制备色谱条件的优化

2.1.1 流动相体系

制备色谱中的有机相（B）为甲醇和乙腈（12∶30）混合溶剂，水相（A）为0.07%磷酸水溶液。结果表明，流动相中有机相为55%进行线性洗脱时，分离效果较好，所有组分出峰情况与分析型液相色谱相似，便于进行对照，为优选条件。

2.1.2 流动相流速

在色谱分析中，流速增加，产物的保留时间减少，制备效率提高，但溶剂用量会增加。相对于分析型液相色谱，制备型液相色谱的流速通常较大，溶剂用量增加的会增加经济负担。本实验分别考察了流速为3 mL/min、5 mL/min、7 mL/min、10 mL/min 时，目标物质的出峰情况。结果表明，流速为7 mL/min时，峰型对称，分离度高，为优选条件。

2.1.3 进样量

为了提高溶剂及色谱柱的利用率，制备色谱柱通常是过载运行，但进样量过大，柱子的分离效能会下降。根据产品纯度及制备效率综合考虑，进样量选为2 mL。

2.1.4 制备色谱条件的最终确定

按上述优化之后的制备色谱条件进行重复进样，半制备液相色谱图如图2所示，目标产物的保留时间为15.287 min。收集该馏分，进行分析液相色谱检测。图3为纯化前的分析液相检测图，图4为馏分的液相检测图，产物的保留时间为13.359 min。通过归一化法计算，纯化后产物的纯度为96%，杂质去除明显，纯化效果良好。

图2 半制备液相色谱图

图3 纯化前样品液相色谱图

图4 纯化后样品液相色谱图

2.2 产物的结构鉴定

2.2.1 化学颜色反应

盐酸镁粉反应呈阳性，锆盐-柠檬酸反应呈阳性，说明该化合物为黄酮类化合物，在A环上存在5-OH。

2.2.2 质谱检测

用质谱对样品溶液中主要物质进行定性，分子离子峰为分别为309.10（[M+Na]+）和285.20（[M-H]-），该物质的分子量为286.15，与目标产物分子量（286.24）一致。

2.2.3 红外光谱检测

使用溴化钾压片法测定样品的固相红外图谱，如图5所示。其中3 390 cm-1、1 380 cm-1和1 290 cm-1吸收峰为羟基相关峰；1 670 cm-1处为羰基吸收峰；1 540 cm-1和1450 cm-1处为共轭芳香体系存在的标志；900～665 cm-1区域内的几个峰归属于芳环上的=C-H面外弯曲振动及C=C键的面内弯曲振动。

图5 样品的红外图谱

2.2.4 核磁共振检测

1H-NMR（DMSO-d6）：δ6.25（1H，S，H-6），δ6.79（2H，d，H-3’，5’），δ7.35（2H，d，H-2’，6’），δ8.33（1H，S，H-2），δ8.72（1H，S，OH-8），δ9.54（1H，S，OH-4’），δ10.52（1H，S，OH-7），δ12.34（1H，S，OH-5）。

在化合物的1H-NMR谱中，化学位移δ12.34、δ10.52、δ9.54、δ8.72处的单峰分别是由5-OH、7-OH、4’-OH上的质子产生。δ6.79和δ7.35处的双峰分别是由3’,5’-H和2’,6-H处的吸收峰产生，与文献一致[15]。

3 结论

本实验利用棘孢曲霉发酵转化槐角浸提液，将槐角苷、染料木苷等黄酮苷转化为代谢产物，利用半制备高效液相色谱法分离纯化产物，产物经结构鉴定为5,7,8,4’-四羟基异黄酮，分子式为C15H10O6。半制备高效液相色谱的操作条件为：色谱柱AQ-C18（22 mm×250 mm，5 μm）；流动相A为0.07%磷酸水溶液，流动相B为甲醇-乙腈（12∶30，V∶V），洗脱方式为55%B线性洗脱；流速为7 mL/min；进样量为2 mL；检测波长260 nm。在该条件下可得到纯度为96%的固体产品。

本文利用半制备高效液相色谱法纯化得到5,7,8,4’-四羟基异黄酮，具有高效、快速、纯化效果好的特点，为制备该物质提供了新的途径。但是该方法也存在溶剂用量大、设备要求高、色谱柱损耗大的缺点，大批量制备物质时成本较高，在后续的研究中，可以继续对该方法进行优化。