刘静远,朱雅君,傅怡宁,易建平,印丽萍

(上海海关动植物食品检验检疫技术中心,上海 200135)

小金蝠蛾(Hepialus xiaojincusisTu,MaetZhang),隶属于鳞翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科(Hepialidae)蝠蛾属(Hepialus),是四川小金县冬虫夏草的寄主昆虫[1],四川省阿坝州小金县是冬虫夏草主要产地。冬虫夏草为冬虫夏草菌(Ophiocordyceps sinensisiBerk.)寄生在蝙蝠蛾科(Hepialidae)昆虫幼虫后形成的虫的僵体和菌的子实体组合体。据研究,冬虫夏草寄主昆虫超过60种[2],大多冬虫夏草产区的寄主昆虫为单一的种类,只有少数种类在多个产地分布[3-4],具有显著的地域分布特征。小金蝠蛾仅产在四川省阿坝州小金县,准确鉴定冬虫夏草寄主小金蝠蛾可实现四川小金县产的冬虫夏草的快速、精准鉴定。

冬虫夏草为寄主蝙蝠蛾科幼虫僵体与菌的复合体,开展寄主昆虫形态鉴定难度较大。针对冬虫夏草寄主昆虫分子水平的系统发育研究主要应用昆虫线粒体基因COI、Cytb以及16S rDNA基因[5-7],上述基因系统发育研究表明,冬虫夏草寄主昆虫的种间差异较小,鉴定困难[8]。现今美国国家生物技术信息中心(NCBI)记录冬虫夏草寄主昆虫COI序列较多,但大多只记录到蝙蝠蛾科(Hepialidae sp.),未能记录到种,这给冬虫夏草寄主昆虫的分子鉴定带来极大困难。

实时荧光PCR方法相对传统PCR方法具有快速、准确、灵敏度高的优点,适用于昆虫等许多类群的快速鉴定。为探寻小金蝠蛾线粒体DNA中可用于实时荧光Taqman探针设计的特异性片段,本研究利用小金蝠蛾线粒体基因组全序列与GenBank数据库中蝙蝠蛾科冬虫夏草寄主昆虫的线粒体DNA序列比对[9],寻找小金蝠蛾稳定的特异性片段,据此设计实时荧光Taqman探针,随后筛选可用探针,并优化反应条件,建立小金蝠蛾实时荧光PCR快速鉴定方法。

1 材料与方法

1.1 标本来源

研究于2019年6月到2020年9月,冬虫夏草产地四川、青海、西藏等地采集冬虫夏草样品,包括四川阿坝州小金县采集的小金蝠蛾成虫、蛹以及小金县产的寄主昆虫为小金蝠蛾的冬虫夏草。因地理距离近,其亲缘关系也较近,选择与小金县较近的四川省阿坝州理县、黑水县采集的冬虫夏草为对照,包括:四川省甘孜州康定县、石渠县冬虫夏草,青海果洛州达日县、军工县冬虫夏草,西藏林芝、西藏亚东冬虫夏草(表1)。标本浸泡于无水乙醇并储存于-20℃冰箱中,保存于上海海关动植物与食品检验检疫技术中心植检实验室。

表1 试验材料具体信息Table 1 Detailed information of experimental material

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取

分别针对小金蝠蛾成虫、蛹、以及冬虫夏草寄主昆虫提取基因组DNA。

取小金蝠蛾成虫以及蛹的头部,使用95%酒精清洗组织表面,将清洗后的组织放置于吸水滤纸上,待酒精挥发后,将组织放入1.5 mL离心管中,用搅拌棒将虫体组织研碎。取冬虫夏草寄主昆虫尾部组织,使用95%酒精清洗组织表面,将清洗后的组织放置于吸水滤纸上,放置2 min,待酒精挥发后,将组织放入1.5 mL离心管中,放至Omni BeadRuptor 24 Elite均质器中,将组织研碎。使用DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen,Germany)试剂盒提取样品基因组DNA,并用NanoVue Plus超微量分光光度计进行DNA浓度测定,记录参数A260∕A280值。

1.2.2 冬虫夏草寄主昆虫的鉴定

1.2.2.1 PCR扩增及测序

为明确冬虫夏草的寄主昆虫为小金蝠蛾,使用引物LCO1490∕HCO2198[10]对寄主昆虫基因组DNA进行扩增。PCR反应体系为50μL,包括:1μL DNA模板(10 ng),引物各1μL(5μmol∕L),5μL dNTPs(10 mmol∕L),5μL 10×PCR buffer(含有Mg2+,TaKaRa Bio.Dalian,China),0.4 g Taq DNA polymerase(TaKaRa Bio.Dalian,China),37μL ddH2O。PCR反应条件为:94℃预变性3 min;94℃变性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸1 min,重复35个循环;最后72℃延伸10 min。

使用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,阳性PCR产物委托华大基因科技有限公司进行双向测序。

1.2.2.2 序列分析

小金蝠蛾线粒体COI序列在GenBank上与已知蝙蝠蛾科昆虫线粒体基因序列比对,参比序列为GenBank数据库中436条蝙蝠蛾科冬虫夏草寄主昆虫线粒体COI序列,具体种类及序列数见表2。表1中样品序号1—3经比对对应到小金蝠蛾,相似度为98.52%—99.24%;序号4—11均比对到不同序列号的Hepialidae sp.,说明序号4—11冬虫夏草寄主昆虫不是小金蝠蛾。

表2 参考序列信息表Table 2 Reference sequences

1.2.3 实时荧光Taqman探针设计及反应条件

1.2.3.1 供试引物和探针的设计

下载GenBank中小金蝠蛾与其他冬虫夏草寄主昆虫线粒体全序列,序列主要为表2序号1、3—7、9。应用MEGA软件进行序列多重比对,寻找小金蝠蛾与其他种类稳定的差异性序列片段,筛选适合于探针、引物设计片段(图1)。使用Primer Primier 5.0辅助进行引物设计,引物和探针由上海基康公司合成。

图1 小金蝠蛾与近似种序列比对Fig.1 Alignment among sequences of H.xiaojincusis and close related species

1.2.3.2 实时荧光PCR反应条件

实时荧光PCR扩增体系25μL(应用大连宝生物公司TaKaRa Premix Ex TaqTM试剂盒):2×Premix Ex Taq 12.5μL,50×ROX Reference Dye 0.5μL,上下游引物(5μmol∕L)各1.0μL,探针(10μmol∕L)1.0μL,DNA模板2.0μL,超纯水补至25μL。

实时荧光PCR扩增在AB 7500 Real-Time PCR System定量PCR扩增仪上进行。反应条件为:预变性95℃30 s;然后95℃5 s,60℃30 s循环40次。

1.2.3.3 特异性检测

以样品XJ01的DNA为模板,水为空白对照,进行实时荧光PCR。选用与小金蝠蛾较近缘的四川省阿坝州黑水县、理县的冬虫夏草、甘孜州康定县、石渠县的冬虫夏草以及西藏、青海等地的冬虫夏草进行小金蝠蛾探针特异性检测。

1.2.3.4 灵敏度测试

在XJ01样品DNA浓度的基础上,进行10倍梯度稀释,经实时荧光PCR测定,反应体系和反应条件不变。

2 结果与分析

2.1 引物与实时荧光Taqman探针筛选

通过比对小金蝠蛾及几个近似种的mtDNA基因序列,最终确定在小金蝠蛾线粒体COIII区段上设计探针(图1)。探针的荧光标记信号FAM,引物分别为XJF2∕XJR2,具体内容见表3。

表3 鉴别小金蝠蛾的实时荧光PCR引物、探针Table 3 Primer and probe used in real-time PCR for diagnosing H.xiaojincusis

2.2 实时荧光PCR检测引物与探针的特异性

经实时荧光PCR扩增,小金蝠蛾特异性探针PC-MGB2对供试的6个小金蝠蛾及寄主昆虫为小金蝠蛾的冬虫夏草样品(表1样品序号1—3)均出现荧光增长曲线,有强的荧光信号增加,表现为阳性扩增,样品扩增曲线参照图2。而供试的6个(表1样品序号4—9)的寄主昆虫非小金蝠蛾的冬虫夏草样品和空白对照则没有检测到荧光信号,表现为阴性,样品扩增曲线参照图3。

图2 TaqMan实时荧光PCR鉴别小金蝠蛾的检测Fig.2 Detection of the TaqMan real-time PCR for diagnosing H.xiaojincusis

图3 小金蝠蛾的TaqMan实时荧光PCR特异性检测Fig.3 Specific detection of H.xiaojincusis with TaqMan real-time PCR

2.3 实时荧光PCR检测的灵敏度

经检测,XJ01DNA样品DNA浓度为334 ng∕μL,其A260∕280值为1.966。将XJ01DNA按10倍梯度稀释,进行实时荧光检测。荧光信号曲线如图4所示,Ct值分别为1号18.43、2号20.95、3号24.59、4号27.72、5号29.64、6号34.53、7号37.39。由于7号的Ct值＞35,无法确定是否为阳性。所以,小金蝠蛾特异性探针PC-MGB2的检测限位DNA浓度为334×10-5ng∕μL,即3.34 pg∕μL。

图4 TaqMan实时荧光PCR鉴别小金蝠蛾的灵敏度检测Fig.4 Sensitivity test of the TaqMan real-time PCR for diagnosing H.xiaojincusis

3 讨论

小金蝠蛾是冬虫夏草优势寄主昆虫,作为优势寄主广泛应用于冬虫夏草的培育领域[11]。冬虫夏草寄主昆虫种类超过60种,种类分布具有地域性[2]。小金蝠蛾仅分布在四川省阿坝藏族羌族自治州小金县,可根据寄主昆虫判定冬虫夏草产地。

昆虫鉴定条形码基因基本集中在线粒体基因上。陈抒云等[6]研究表明,线粒体COI基因适合用于冬虫夏草寄主昆虫DNA条形码研究,全庆梅[12]研究表明,COI基因较COII、Cytb基因更能反映冬虫夏草寄主昆虫的遗传分化。彭树英等[7]用16S rDNA基因分析了冬虫夏草寄主蝠蛾的系统进化关系,认为该基因可用于科属级分类标记基因。但GenBank上记录的冬虫夏草寄主昆虫序列大多为COI序列,且只记录到蝙蝠蛾科,只有少数种类到种,这使基于DNA条形码的冬虫夏草寄主昆虫的分子鉴定缺少标准对照。

本研究针对局限分布的小金蝠蛾探索实时荧光特异性Taqman探针鉴定方法,为小金蝠蛾的鉴定提供了一种新方法,对小金蝠蛾成虫、蛹以及寄主冬虫夏草昆虫小金蝠蛾均能精准鉴定,较之使用线粒体COI基因序列比对鉴定小金蝠蛾的方法省去了电泳跑胶、序列比对等程序。在引物与探针的双重保证下,完成了小金蝠蛾的实时荧光PCR快速、精准鉴定,基于此,可探索基于寄主昆虫的冬虫夏草产地溯源研究。根据试验灵敏度测试结果,对样品的DNA最低浓度要求可达到pg级,灵敏度较高。