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T细胞受体γ位点反义RNA 1、人抗原R、三元基序家族蛋白21、缺氧诱导因子-1α在结直肠癌组织中的表达及临床意义△

2023-01-14柴小兵褚菲菲肖兴国吴慧丽

癌症进展 2022年23期
关键词:生存率阳性率直肠癌

柴小兵,褚菲菲,肖兴国,吴慧丽

郑州大学附属郑州中心医院消化内科,河南省结直肠癌诊治医学重点实验室,郑州市结直肠癌诊治与研究重点实验室,郑州 450007

结直肠癌是临床中常见的一种消化系统恶性肿瘤,其发病与大肠腺瘤、遗传因素、生活习惯等存在密切关系,常见的临床症状为腹痛、便血以及大便性状改变等,多见于中老年人群,男性发病率高于女性,近年来结直肠癌的发病率呈上升及年轻化趋势[1]。目前,手术是治疗结直肠癌的主要方法之一,早期明确诊断并及时给予针对性治疗可以使患者获得较好预后。研究指出,复发转移是影响结直肠癌患者预后的主要因素。结直肠癌的复发转移机制复杂,某些与肿瘤相关的因子可能起到重要作用[2]。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)与恶性肿瘤有关,T细胞受体γ位点反义RNA 1(T cell receptor gamma locus antisense RNA 1,TRG-AS1)是近年来新发现的一种恶性肿瘤相关lncRNA[3]。缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)不仅参与恶性肿瘤新生血管生成,而且在能量代谢过程中具有重要作用[4]。人抗原R(human antigen R,HuR)是胚胎致死性异常视觉基因的蛋白质产物,可以对mRNA的不稳定性进行调节,与多种恶性肿瘤的发生有关[5]。三元基序家族蛋白21(tripartite motif-containing protein 21,TRIM21)是TRIM家族的重要成员,在肿瘤细胞生长和增殖等方面起到重要的调控作用[6]。本研究分析 TRG-AS1、HuR、TRIM21、HIF-1α在结直肠癌组织中的表达及临床意义,旨在为结直肠癌的治疗提供依据,现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年1月至2019年6月于郑州大学附属郑州中心医院接受手术治疗的结直肠癌患者。纳入标准:①经病理检查确诊为结直肠癌;②初次行手术治疗;③术前未接受过生物免疫治疗或放化疗等;④临床资料及随访资料完整。排除标准:①合并其他部位恶性肿瘤;②合并免疫系统疾病、心脑血管疾病或血液系统疾病;③合并全身性感染。依据纳入和排除标准,本研究共纳入103例患者。其中,男性68例,女性35例;年龄34~77岁,平均(54.97±10.68)岁。收集103例结直肠癌患者的结直肠癌组织及癌旁组织(距结直肠癌组织5 cm以上),所有标本均置于低温保存管,经液氮处理后置于-80℃冰箱中保存备用。本研究经医院伦理委员会审批通过,所有患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 检测方法

1.2.1 免疫组织化学染色法检测HuR、TRIM21、HIF-1α表达情况及结果判定 石蜡包埋处理标本,连续切片,厚度为4 μm左右;将切片脱蜡和水化,通过高压锅修复抗原,时间为2 min;封闭液孵育60 min;滴加HuR、TRIM21、HIF-1α一抗工作液50 μl,4℃孵育过夜;磷酸盐缓冲液冲洗3次,滴加二抗工作液50 μl,室温下孵育30 min;加入二氨基联苯胺显色,分别应用苏木精及梯度乙醇进行复染和脱水,然后进行固封和镜检。采用荧光倒置显微镜观察染色结果。阳性细胞比例评分:<25%为1分,25%~50%为2分,51%~75%为3分,>75%为4分。染色强度评分:无色为0分,淡黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分。阳性细胞比例评分和染色强度评分相乘,0分为阴性,1~4分为弱阳性,5~8分为中等阳性,9~12分为强阳性,其中1~9分为阳性。

1.2.2 实时定量逆转录聚合酶链反应(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测TRG-AS1相对表达量 应用Trizol试剂提取总RNA,然后应用PrimeScript逆转录酶试剂盒将RNA逆转录为cDNA。采用SYBR Green PCR试剂盒进行基因扩增,引物由武汉擎科生物技术有限公司设计合成,TRG-AS1上游引物5'-ATGAAGAAGCCGCGAAGTGT-3',下游引物 5'-CACACCCTAATACACATGCCCT-3';甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)上游引物5'-TCGACAGTCAGCCGCATCTT-3',下游引物5'-GGCGCCCAATACGACCAAAT-3'。PCR反应条件:95℃预变性5 min,95℃变性20 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,共40个循环,最后72℃延伸5 min。以GAPDH为内参,采用2-△△Ct法检测TRG-AS1的相对表达量。

1.3 随访方法

出院后第1天开始随访,通过门诊复查或电话、微信等电子通讯的方式进行随访,随访截止时间为2022年3月,以患者死亡或复发为随访终点。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。正态分布计量资料以均数±标准差(±s)表示,多组间比较采用方差分析,两组间比较采用t检验;计数资料以例数和率(%)表示,组间比较采用χ2检验或McNemar检验;采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,组间比较采用Log-rank检验;以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌组织和癌旁组织中TRG-AS1、HuR、TRIM21、HIF-1α表达情况的比较

结直肠癌组织中TRG-AS1相对表达量为(1.50±0.50),明显高于癌旁组织的(0.71±0.19),差异有统计学意义(t=9.281,P<0.01)。结直肠癌组织中HuR、HIF-1α阳性率分别为65.05%(67/103)、76.70%(79/103),分别明显高于癌旁组织的10.68%(11/103)、14.56%(15/103),差异均有统计学意义(P<0.01)。结直肠癌组织中TRIM21阳性率为30.10%(31/103),明显低于癌旁组织的91.26%(94/103),差异有统计学意义(P<0.01)。

2.2 不同临床特征结直肠癌患者结直肠癌组织中TRG-AS1、HuR、TRIM21、HIF-1α表达情况的比较

不同分化程度、淋巴结转移情况、血管侵犯情况结直肠癌患者结直肠癌组织中TRG-AS1相对表达量比较,差异均有统计学意义(F=14.116、t=4.688、t=3.038,P<0.05);不同浸润深度、TNM分期、淋巴结转移情况结直肠癌患者结直肠癌组织中HuR阳性率比较,差异均有统计学意义(χ2=5.864、9.938、7.237,P<0.05);不同浸润深度、TNM分期、淋巴结转移情况结直肠癌患者结直肠癌组织中TRIM21阳性率比较,差异均有统计学意义(χ2=45.537、7.908、5.859,P<0.05);不同浸润深度、TNM分期、淋巴结转移情况结直肠癌患者结直肠癌组织中HIF-1α阳性率比较,差异均有统计学意义(χ2=5.498、5.804、5.499,P<0.05)。(表1)

表1 不同临床特征结直肠癌患者结直肠癌组织中TRG-AS1、HuR、TRIM21、HIF-1α的表达情况

2.3 不同TRG-AS1、HuR、TRIM21、HIF-1α表达情况结直肠癌患者预后的比较

随访至2022年3月,103例患者中死亡36例,生存67例,生存率为65.05%。以TRG-AS1相对表达量的中位值为界,中位值以上为高表达,中位值及以下为低表达;TRG-AS1低表达患者的累积生存率为55.6%,高于TRG-AS1高表达患者的31.5%,差异有统计学意义(χ2=6.493,P=0.011)。HuR阴性患者的累积生存率为56.9%,高于HuR阳性患者的37.0%,差异有统计学意义(χ2=4.824,P=0.028)。TRIM21阴性患者的累积生存率为22.4%,低于TRIM21阳性患者的59.0%,差异有统计学意义(χ2=5.827,P=0.015)。HIF-1α阴性患者的累积生存率为72.0%,高于HIF-1α阳性患者的36.6%,差异有统计学意义(χ2=4.422,P=0.035)。(图1)

图1 不同TRG-AS1、HuR、TRIM21、HIF-1α表达情况结直肠癌患者的生存曲线

3 讨论

结直肠癌具有较高的发病率及病死率,特别是中晚期患者,即使接受手术、化疗、放疗等综合治疗,其预后情况仍不容乐观。近年来,随着生物信息学、基因检测技术的发展,多种新型肿瘤标志物逐渐被发现[7]。结直肠癌发病的分子机制尚未明确,仍需要进一步研究其治疗靶点。

本研究结果显示,结直肠癌组织中TRG-AS1相对表达量明显高于癌旁组织,说明TRG-AS1可能作为一种促癌基因参与结直肠癌的发生发展过程。lncRNA异常表达在恶性肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用,有学者指出,TRG-AS1能够通过影响微小 RNA(microRNA,miRNA)-877-5p对Zeste 12同源物1抑制因子2(suppressor of zeste 12 homolog,SUZ12)的表达情况进行调控,从而促进胶质母细胞瘤进展[8]。He等[9]研究指出,TRG-AS1可以通过调控miRNA-543/Yes相关蛋白1信号通路促进舌鳞状细胞癌的发生。目前关于TRG-AS1在结直肠癌中表达上调的机制尚不清楚。分析其原因可能是TRG-AS1受其他转录因子调控或编码基因发生突变导致[10]。本研究结果显示,不同分化程度、淋巴结转移情况、血管侵犯情况结直肠癌患者结直肠癌组织中TRG-AS1相对表达量比较,差异均有统计学意义(P<0.05),说明TRG-AS1表达水平与结直肠癌患者病情严重程度有关。研究表明,上皮-间充质转化在结直肠癌进展、转移和耐药中发挥重要作用,而TRG-AS1下调有效地抑制了上皮-间充质转化,TRG-AS1表达水平升高后对上皮-间充质转化的抑制作用减弱[11]。

据报道,许多转录因子参与了恶性肿瘤某些关键的生物学过程,包括细胞增殖、凋亡、新生血管生成、免疫反应和转移等,与患者的生存率存在密切关系[12]。HuR是一种RNA结合蛋白,已被证明通过不同的转录后机制(如mRNA衰变和蛋白质翻译)调节多个基因的表达[13]。本研究结果显示,结直肠癌组织中HuR阳性率明显高于癌旁组织,不同浸润深度、TNM分期、淋巴结转移情况结直肠癌患者结直肠癌组织中HuR阳性率比较,差异均有统计学意义(P<0.05),表明HuR能够反映结直肠癌患者病情严重程度。B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)、c-Myc、细胞周期蛋白D(cyclin D)和细胞周期蛋白A(cyclin A)基因为HuR的下游分子,这些基因均参与了细胞增殖和细胞周期等过程,如转录因子c-Myc可调节10%~15%的人类基因表达,在细胞增殖、分化、生长和存活过程中发挥重要作用;细胞周期蛋白是细胞周期的基本调节因子,在肿瘤发生中发挥重要作用,cyclin A是细胞通过S期所必需的[14]。HuR通过上调Bcl-2、c-Myc、cyclin D和cyclin A基因表达调节肿瘤细胞增殖和凋亡,促进结直肠癌的发生发展[15]。

TRIM21是TRIM超家族成员,已被发现是多种自身免疫疾病(如炎症性肠病、系统性红斑狼疮和风湿性疾病等)的关键调节因子,而且有研究证实,TRIM21是肝细胞癌中潜在的肿瘤抑制因子[16]。本研究结果显示,结直肠癌组织中TRIM21阳性率明显低于癌旁组织,说明结直肠癌中TRIM21发挥抑癌基因的作用。Zhou等[17]研究指出,TRIM21在结肠炎相关肿瘤中表达下调,通过调节肿瘤细胞增殖、黏附、组织重塑、血管生成以及炎症反应来负调节结肠上皮癌变,进而降低结直肠癌的发生风险。本研究结果显示,不同浸润深度、TNM分期、淋巴结转移情况结直肠癌患者结直肠癌组织中TRIM21阳性率比较,差异均有统计学意义(P<0.05),表明TRIM21可反映结直肠癌患者病情严重程度。其原因可能是TRIM21能够介导蛋白酶体降解以及Snail蛋白泛素化,调节上皮-间充质转化过程,进而抑制结直肠癌细胞的侵袭和转移[18]。

HIF-1α在恶性肿瘤对缺氧的反应中发挥重要作用,在缺氧条件下HIF-1α信号被激活,参与肿瘤的侵袭、转移以及对放疗和化疗的抵抗[19]。本研究结果显示,结直肠癌组织中HIF-1α阳性率明显高于癌旁组织,说明结直肠癌中HIF-1α发挥促癌基因的作用。HIF-1α表达上调与抑癌基因突变、促癌基因激活有关,还可能与组织氧浓度降低有关。本研究结果显示,不同浸润深度、TNM分期、淋巴结转移情况结直肠癌患者结直肠癌组织中HIF-1α阳性率比较,差异均有统计学意义(P<0.05),表明HIF-1α水平同样可反映结直肠癌患者病情严重程度。其原因可能是HIF-1α表达上调可以促进上皮-间充质转化,进而增强肿瘤细胞的侵袭和转移能力;另外,在缺氧状态下,HIF-1α也可以通过诱导p53表达促进肿瘤细胞增殖[20]。本研究还发现,TRG-AS1低表达、HuR阴性、TRIM21阳性、HIF-1α阴性结直肠癌患者的累积生存率分别高于TRGAS1高表达、HuR阳性、TRIM21阴性、HIF-1α阳性患者(P<0.05),说明 TRG-AS1、HuR、TRIM21、HIF-1α表达情况与结直肠癌患者预后有关,可能作为评估结直肠癌患者预后的标志物。

综上所述,结直肠癌组织中TRG-AS1、HIF-1α及HuR表达均升高,TRIM21表达降低,TRG-AS1、HuR、TRIM21、HIF-1α表达情况与结直肠癌侵袭、转移及患者预后密切相关,对评估结直肠癌患者病情及预后具有一定的临床价值。

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