李 雪，徐 雅，杜庆红，白俊杰，王 旭，李 靖

(1.北京中医药大学中医学院，北京 102401；2.北京中医药大学，北京 100029；3.西藏藏医药大学，拉萨 850000)

失眠属于中医学“不寐”范畴，指出现持续而频繁的入睡困难、睡眠维持困难，以睡眠满意度不足为特征的睡眠障碍[1]。中医认为不寐的病机为阴阳气血失调、营卫失和，可分为肝火扰神证、痰热扰神证、心胆气虚证、心肾不交证、心脾两虚证5种证型，五脏中与心肾的关系最为密切[2]。长期的心肾不交使五脏六腑气血阴阳失衡，出现入睡困难、睡眠时间短、多梦等各种不寐症状，重者影响神志、脏腑且容易反复，难以治愈。

现代医学应用的镇静安神类药物存在一定的药物依赖性，滥用亦会损伤躯体功能并加重失眠[3]。民族医药治疗失眠从病机入手效果良好，副作用小，是临床重要的治疗手段。本文基于中医对心肾不交证失眠的认识，同时结合临床经验，选择藏黄连、肉豆蔻、力噶都、红花4味药组成自拟安神方(以下简称安神方)，观察其对心肾不交证失眠大鼠的影响及作用机制，为临床诊疗提供实验依据。本研究通过北京中医药大学动物伦理委员会批准(批号BUCM-4-2022040102-2025)。

1 材料

1.1 动物

SPF级健康雄性SD大鼠60只，6周龄，体质量180 g～220 g，购于北京斯贝福有限公司，实验动物许可证号SCXK(京)2019-0010。动物饲养于北京中医药大学SPF级动物房，正常饮水，普通动物饲料，室温(20±2)℃，湿度30%～40%。

1.2 主要药物及制备

藏黄连饮片(货号19992036)、肉豆蔻饮片(货号20000098)、力噶都饮片(货号20000567)、红花饮片(货号20000307)，黄连饮片(货号20000208)、肉桂饮片(货号20000306)，北京上医仁家中医诊所有限公司，生产许可证号(京)20180032。

安神方高剂量含藏黄连56 g，肉豆蔻56 g，力嘎都84 g，红花16.8 g，安神方中剂量药量减半，安神方低剂量再减半，采用水煎法煎煮2次后混合药液浓缩至安神方高、中、低剂量每1 mL含生药各0.76 g、0.38 g、0.19 g。交泰丸中黄连、肉桂按照6∶1比例水煎，煎煮2次后交泰丸混合药液浓缩至每1 mL含生药6 g。

1.3 主要试剂、配制方法及仪器

DL-4-氯苯基丙氨酸(para-chlorophenylalanine，PCPA)(法国Acros公司，货号157280250)；促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin releasing hormone，CRH)、促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone, ACTH)、皮质醇(cortisol,CORT)的Elisa检测试剂盒(上海蓝基生物科技有限公司，货号分别为E02C0372、E02A0005、E02C0008)；碳酸氢钠、无水碳酸钠(北京百瑞极生物科技有限公司,货号分别为BN23023、BN23025)；戊巴比妥钠(美国Sigma公司,货号20170318)；多巴胺(dopamine，DA)标准品(上海源叶公司,货号B60897)；5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)标准品(美国Sigma公司,货号H9523)。

PCPA 注射液的配制：称取3.392 g无水碳酸钠溶于320 mL蒸馏水，称取1.512 g碳酸氢钠溶于180 mL蒸馏水，搅拌混合后配制成缓冲液，使pH值达到7.0。称取6.75 g的PCPA粉末，溶于150 mL缓冲液中,配制成浓度为45 g·L-1的混悬液。

ELX-800型酶标仪，美国BIOTEK公司；QB-9002型微量快速震荡仪，中国海门其林贝尔公司；H1850R型离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；TY2018001416型高效液相色谱电化学分析仪，美国戴安公司。

2 方法

2.1 动物造模及分组

表1示，SD大鼠适应性饲养7 d后随机分为正常组和PCPA组，依据Murray N M[4]等提出的PCPA法和郜红利[5]等提出的多因素方法制备模型。PCPA组造模方法：复合因素刺激14 d后，腹腔注射PCPA(450 mg·kg-1)，连续注射3 d。正常组大鼠在前2周里内正常喂食饮水，不施加任何刺激因素，第15～17天注射等体积的0.9%氯化钠溶液。第18天时应用戊巴比妥钠翻正实验和旷场实验验证心肾不交证失眠模型是否成功。将造模成功的PCPA组大鼠随机分为模型组，安神方高、中、低剂量组、阳性对照组，另设正常组每组10只，分别灌胃相应药物2周。

表1 多因素造模方法比较

2.2 给药方法

按临床试验方法计算安神方高、中、低剂量组给药浓度分别为0.076 g·kg-1·d-1、0.038 g·kg-1·d-1、0.019 g·kg-1·d-1，阳性对照组给予交泰丸混悬液，给药浓度为0.6 g·kg-1·d-1，每日1次，连续14 d。正常组和模型组大鼠给予等量的0.9%氯化钠溶液。实验第32天时所有大鼠再次进行旷场实验和戊巴比妥钠翻正实验。

2.3 一般情况观察

观察各组大鼠的行为表现、运动情况、失眠情况、毛发光泽、精神状态和体质量的变化。

2.4 旷场实验

于第0天、第18天、第32天早上8∶00进行旷场实验，将大鼠轻放在旷场箱正中观察5 min内大鼠的活动情况。每只大鼠测试结束之后，将旷场箱清理干净并用酒精擦拭。用行为学分析软件分析记录总活动距离、修饰次数、中央格停留时间、直立次数、穿中央格次数。

2.5 戊巴比妥钠翻正实验

戊巴比妥钠翻正实验评价模型是否成功以及给药效果。预实验测得翻正实验大鼠腹腔注射戊巴比妥钠剂量为0.40 mg·kg-1。正式实验分别于第18天和第32天麻醉各组大鼠，记录腹腔注射药物时间、大鼠入睡时间与大鼠苏醒时间，大鼠60 s内不翻动视为翻正反射消失，检测指标为大鼠睡眠持续时间和睡眠潜伏期。睡眠持续时间：大鼠翻正反射消失到苏醒的时间；睡眠潜伏期为大鼠开始麻醉到大鼠翻正反射消失的时间。

2.6 取材

取材前1天禁食不进水，第33天时腹腔注射戊巴比妥钠注射液(0.45 mg·kg-1)麻醉取材。取动脉血后静置1 h低温离心取上清，取血清做Elisa实验。冰上取下丘脑后迅速装入去酶冻存管，置于-80 ℃低温冰箱保存。

2.7 Elisa法检测大鼠血清中CRH、ACTH、CORT含量

按照Elisa试剂盒说明书测定各组大鼠血清中CRH、ACTH、CORT含量。

2.8 高效液相色谱-电化学法测定下丘脑DA和5-HT的含量

取下丘脑组织冰盒上精密称重，以1∶5000的比例加入0.1 mol/L的高氯酸裂解液。超声破碎仪破碎脑组织，离心后取上清，-80 ℃保存。配制单胺类流动相、超纯水、纯乙腈、异丙醇。C18高效液相色谱柱，35 ℃柱温，标准品10 μL或样品20 μL的进样量，以0.2 mL/min的流速观察DA、5-HT的出峰时间[6]。

2.9 统计学方法

3 结果

3.1 模型评价结果

3.1.1 造模后大鼠一般情况观察结果 图1示，多因素刺激14 d以及注射PCPA混悬液3 d后，PCPA组大鼠体质量比正常组明显减轻(P<0.05)。PCPA组大鼠白天活动量增加，白天睡眠时间减少，精神萎靡不振，鼠毛干枯无光泽、发黄，尿量减少，颜色发黄，进食、饮水量明显增加，对外界刺激敏感、易激惹，容易惊恐，打斗情况增加，攻击力上升，出现撕咬等情况。

注：与正常组比较：*P<0.05；DL-4-氯苯基丙(para-chlorophenylalanine，PCPA)

3.1.2 造模后大鼠旷场实验结果 图2示，采用行为学中的旷场实验观察大鼠的紧张和焦虑情绪。与正常组比较，PCPA组大鼠的总活动距离明显增加(P<0.05)，中央格停留时间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

注：与正常组比较：*P<0.05；DL-4-氯苯基丙氨酸(para-chlorophenylalanine，PCPA)

3.1.3 造模后大鼠睡眠质量结果 图3示，应用戊巴比妥翻正实验检测大鼠的睡眠质量。与正常组比较，PCPA组大鼠的睡眠潜伏期明显变长(P<0.01)，睡眠持续时间缩短(P<0.01)，证明失眠模型建立成功。PCPA组大鼠昼夜节律紊乱，白天睡眠时间减少，精神消极，毛发枯黄，符合心肾不交证特征。

注：与正常组比较：**P<0.01；DL-4-氯苯基丙氨酸(para-chlorophenylalanine，PCPA)

3.2 安神方对心肾不交证失眠模型大鼠的影响

3.2.1 安神方对各组大鼠一般情况的影响 图4示，治疗14 d后模型组大鼠体质量增量低于正常组(P<0.05)，模型组大鼠精神差，毛发枯燥、易掉毛，舌苔紫暗，易激惹。与模型组比较，阳性对照组与安神方3剂量组2周体质量增量显著增加(P<0.05)，大鼠毛发脱落减少。阳性对照组大鼠舌苔紫暗情况减轻，打斗次数减少，白天较给药前安静。

注：Z组：正常组；M组：模型组；JT组：阳性对照组；ASFD组：安神方低剂量组；ASFZ组：安神方中剂量组；ASFG组：安神方高剂量组;与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

3.2.2 安神方对各组大鼠旷场实验的影响 图5示，与正常组比较，模型组大鼠总活动距离增加，直立次数增加(P<0.05)，其余指标差异无统计学意义(P>0.05)。与模型组比较，阳性对照组、安神方低、中剂量组大鼠总活动距离均缩短(P<0.05)，阳性对照组、安神方3剂量组的直立次数均减少(P<0.05)。

注：Z组：正常组；M组：模型组；JT组：阳性对照组；ASFD组：安神方低剂量组；ASFZ组：安神方中剂量组；ASFG组：安神方高剂量组；与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

3.2.3 安神方对各组大鼠睡眠质量的影响 图6示，与正常组比较，模型组大鼠睡眠潜伏期延长(P<0.01),睡眠持续时间缩短(P<0.01)；与模型组比较，阳性对照组、安神方中、高剂量组大鼠睡眠潜伏期时间均显著缩短(P<0.01)，阳性对照组、安神方3剂量组睡眠持续时间均显著延长(P<0.01)。

注：Z组.正常组；M组.模型组；JT组.阳性对照组；ASFD组.安神方低剂量组；ASFZ组.安神方中剂量组；ASFG组.安神方高剂量组；与正常组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01

3.2.4 安神方对各组大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamic pituitary adrenal axis，HPA)功能的影响 图7示，与正常组比较，模型组大鼠血清CRH含量升高(P<0.05)，ACTH、CORT含量差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，阳性对照组、安神方3剂量组的CRH含量降低(P<0.05)。

注：Z组：正常组；M组：模型组；JT组：阳性对照组；ASFD组：安神方低剂量组；ASFZ组：安神方中剂量组；ASFG组：安神方高剂量组；促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)，促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin releasing hormone，CRH)，皮质醇(cortisol，CORT)；与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

3.2.5 安神方对大鼠下丘脑DA和5-HT含量的影响 图8、9示，与正常组比较，模型组大鼠下丘脑DA含量升高(P<0.05)，5-HT含量下降(P<0.05)；与模型组比较，阳性对照组、安神方中、高剂量组DA含量降低(P<0.05)，安神方低剂量组5-HT含量升高(P<0.05)。

注：Z组：正常组；M组：模型组；JT组：阳性对照组；ASFD组：安神方低剂量组；ASFZ组：安神方中剂量组；ASFG组：安神方高剂量组;多巴胺(dopamine，DA),5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)；与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

4 讨论

心肾不交证不寐表现为心烦不寐、心悸、眩晕、五心烦热、咽干口燥、消瘦、舌红、脉细数等症状。造模后大鼠出现体质量下降，舌质紫暗，精神萎靡不振，毛发干枯无光泽、发黄，尿量变少，容易暴躁易怒，表现出心火亢盛、肾阴亏虚的症状，符合中医心肾不交证失眠的表现。中医治疗心肾不交证失眠多交通心肾，调整脏腑阴阳为治，方药用交泰丸，临床显示，交泰丸可改善患者睡眠质量，改善神经递质5-HT、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)和谷氨酸(glutamic acid，Glu)的比值[7]。

藏医认为失眠的发生与体内“隆”的偏盛有关，而隆、赤巴和培根是构成人体的物质基础，也是进行生命活动不可缺少的能量和基础，隆的失衡必然会导致赤巴和培根功能的异常，使机体出现寒热混杂现象，因而导致阳不入阴、阴阳失交遂致失眠，其发病机理与中医的心肾不交证失眠极其相似。根据多年临床经验，课题组仿交泰丸创立自拟安神方，方中以藏黄连和肉豆蔻为主药，其中藏黄连清热解毒，以治五脏有热；肉豆蔻散寒消隆,二药相合既清热又散寒，可调整寒热、平衡阴阳；力噶都有清热解毒功效，配入方中以加强藏黄连清热之功；红花取其活血化瘀功效，用以疏通“病久入络”所致的瘀堵，4味相合共奏调整寒热、活血化瘀、安神定志之功。

图9 各组大鼠下丘脑多巴胺(dopamine，DA)、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)高效液相色谱图

行为学实验选用戊巴比妥钠翻正实验和旷场实验。行为学实验用以检测造模结果和安神方的作用，同时旷场实验还用以检测大鼠焦虑情绪的变化。旷场实验的中央格穿越次数及停留时间可以反映大鼠的焦虑以及抑郁的程度[8]，直立次数和修饰次数反映大鼠在陌生环境中的活跃程度及探究度[9]。大鼠越紧张总活动距离越长，由此可以反映大鼠的紧张、焦虑程度[10]。本实验结果表明，造模后PCPA组大鼠睡眠潜伏期延长，睡眠持续时间缩短，总活动距离增加，说明实验模拟心肾不交证失眠患者烦躁易怒、精神亢奋的症状表现成功，大鼠具有明显的焦虑行为，与刘莹[11]等实验结果一致，进一步说明造模成功。给药后安神方3剂量组以及阳性对照组均可以缩短睡眠潜伏期，延长睡眠持续时间，并且大鼠的总活动距离、直立次数比模型组减少，说明药物可以缓解大鼠的焦虑、紧张状态，从而改善睡眠。

HPA轴功能紊乱是心肾不交证的生物学机制之一。HPA轴是机体维持体内环境的稳态和调控应激反应的重要生理学基础[12]。下丘脑是HPA轴负反馈调节通路的首要环节，HPA轴分泌的CRH、ACTH、CORT彼此相互影响。应激状态下，HPA轴被激活后CRH的分泌随之增加，ACTH 和CORT 的浓度也同时升高，从而导致失眠[13]，且HPA轴对睡眠的影响关键在于CRH[14]。当机体受到刺激时，HPA轴亢进会诱发激素级联反应，引起分子水平的改变，从而导致失眠[15]。有研究报道，交泰丸可显著调节失眠大鼠的HPA轴激素水平[16]。本实验安神方各剂量均能显著抑制CRH和CORT合成，可能为安神方改善睡眠的机制之一。

DA和5-HT亦会参与调控睡眠-觉醒通路，是脑内重要的单胺类神经递质。5-HT含量的减少与失眠有关[17]。当大脑中DA的浓度增加时，中枢神经系统兴奋性增加，从而促进觉醒。清·陈士铎[18]认为，心肾不交可因肾水过盛太寒，水趋于下不得上升济心火，心火独亢导致失眠。神经递质的失调会影响生理活动，因此神经递质可以作为信号传导，为“心肾相交”理论提供现代生物学依据[19-22]。本实验结果表明，安神方低、高剂量组在降低DA含量、提高5-HT含量、抑制兴奋作用方面效果较好，说明安神方对抑制性神经递质和兴奋性神经递质具有双向调节作用，故能交通心肾，活血化瘀，安神定志。

综上所述，自拟安神方可以显著改善大鼠心肾不交证失眠，其机制可能与抑制HPA轴相关激素CRH和CORT合成，调控脑组织中兴奋性神经递质和抑制性神经递质的合成有关，其深层次机制还需进一步研究。