许馨予，杨鹄隽,2，贾 斌,3，张慧敏,3，左 锋,2,*

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江 大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学 国家杂粮工程技术研究中心，黑龙江 大庆 163319；3.粮食副产物加工与利用教育部工程研究中心，黑龙江 大庆 163319）

Pickering乳液指超微固体颗粒经高速剪切乳化后被吸附在油水界面而形成的乳化液，具有粒径分布可控、制备方法简单等优点，其稳定性取决于固体颗粒的物理化学性质及界面层的黏弹性[1-2]。一般的无机表面活性剂具有一定毒性，在食品工业中应用受限。因此，选择生物大分子代替表面活性剂制备Pickering乳液，如蛋白质、多糖、纤维素、淀粉等，这些物质是构成食品的主要营养成分，不仅能够为机体提供能量，维持新陈代谢，还具有一定抗氧化能力，起到预防慢性疾病发生的作用[3-5]。

单一大分子物质制备的Pickering乳液稳定性及流变特性较差，而通过分子间交联制备的复合乳液则表现出良好的理化性质。鞠梦楠等[6]对大豆球蛋白与花青素共价复合Pickering乳液进行研究，得到的复合乳液与大豆球蛋白乳液相比，乳化性增至127 m2/g，乳化稳定性升高近1 倍，油滴状态发生显著改变，表现出明显的桥接乳液状态。Feng Tingting等[7]利用豌豆分离蛋白-高甲氧基果胶-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物制备高内相Pickering乳液，结果表明复合物具有一定的表面湿润性，复合乳液形成了稳定的界面层，复合颗粒均匀包裹油滴，表现出较高的乳液稳定性。马翠翠等[8]利用热诱导及静电处理构建乳铁蛋白-多糖-表没食子儿茶素没食子酸酯三元复合物以用来递送姜黄素，结果表明多糖参与形成的双层乳液能有效阻止液滴的聚集，抑制姜黄素的降解，提高姜黄素的生物可及性和贮藏稳定性。Yi Fengping等[9]为制备一种亲脂性功能食品的保护传递介质，采用共价交联技术将大豆分离蛋白与没食子酸结合并制备Pickering乳液，得到的乳液在碱性条件下粒径小、Zeta电位高，具有较高稳定性，此外，在不添加防腐剂的前提下，添加较高浓度没食子酸的组分还表现出一定的抗菌能力。复合乳液具有良好的表面湿润性、界面性质，能够促进界面吸附，并形成稳定的界面层，在亲脂性功能食品的运输及贮藏领域具有潜在应用价值。

果胶作为天然植物多糖，无毒无味，且具有良好的乳化稳定性及增稠特性[10]，其与蛋白质结合形成的共价复合物是制备Pickering乳液重要原料，但二元复合物的理化性质较差可能导致复合物流变特性及稳定性等方面不足[11]，Jie Yang等[12]报道将多酚应用于蛋白质-多糖体系中可以通过酚类物质与蛋白质相互作用增强复合物的表面疏水性，从而改变其流变特性及稳定性，因此通过选择合适原料构建一种三元复合物，提升复合乳液稳定性、拓展其在亲脂性食品中的贮存和运输具有重要意义。本研究以大豆分离蛋白、高酯柑橘果胶及没食子酸作为研究对象，制备一种蛋白质-多糖-多酚基复合物，通过正交试验对其制备的工艺进行优化，并利用流变特性、粒径分布、Zeta电位进对Pickering乳液性能进行表征，结合复合乳液的微观形态特征，探讨其形成及稳定机理。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆分离蛋白、高酯柑橘果胶、没食子酸、茶籽油，以上均为食品级。

盐酸、氢氧化钠、叠氮磷酸二苯酯（diphenyl azidophosphate，DPPA），均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-2600i紫外分光光度计 日本岛津仪器有限公司；FM-30D数显高剪切分散乳化机 德国弗鲁克仪器有限公司；ARES-G2流变仪 美国TA仪器有限公司；Nano-v4电位仪 马尔文仪器有限公司；DM-750光学显微镜 北京普瑞赛斯仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆分离蛋白-高酯柑橘果胶-没食子酸复合物制备

参考Feng Tingting等[7]的研究方法，略有修改。

1）将30 g大豆分离蛋白分散在1 500 mL蒸馏水中（20 mg/mL），在室温下搅拌60 min，在4 ℃沉淀过夜。将pH值调整到12，溶液在90 ℃加热30 min。

2）将30 g高酯柑橘果胶溶解在1 500 mL蒸馏水中搅拌60 min，持续搅拌，制备果胶（20 mg/mL）原液，在4 ℃沉淀过夜。

3）大豆分离蛋白和高酯柑橘果胶溶液以1∶1（V/V）混合，用1 mol/L的NaOH或HCl溶液调整pH值（1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5），以350 r/min搅拌60 min。将不同量的没食子酸（30、60、90、120、150 mg）溶解在120 mL大豆分离蛋白-高酯柑橘果胶溶液中，加入0.02 mL DPPA，以防止微生物感染，在不同温度下（25、35、45、55、65 ℃）持续搅拌60 min，取出，在波长600 nm处测其吸光度。

在单因素试验的基础上，以pH值、温度、没食子酸含量为因素，以波长600 nm处的吸光度为评价指标，设计3因素3水平正交试验优化各因素，因素与水平见表1。

表1 正交试验因素与水平Table 1 Code and level of independent variables used for orthogonal array design

1.3.2 场发射扫描电子显微镜表征

参照周浓等[13]的方法，取大豆分离蛋白、大豆分离蛋白-高酯柑橘果胶-没食子酸复合物，进行固定、喷金，用场发射扫描电子显微镜各放大100 倍和500 倍，观察微观结构特性。

1.3.3 Pickering乳液制备

参照Liu Zhongbo等[14]的方法，略有修改。利用高速剪切乳化机将200 mL不同油相体积分数φ（0.4、0.5、0.6、0.7、0.8）的茶籽油与复合溶液在12 000 r/min均质2 min制备Pickering乳液。

1.3.4 流变特性

采用动态流变仪测定不同含油量的Pickering乳液的动态黏弹性，测试参数：采用C35/1 Ti锥板，间距1 mm，频率扫描范围0.1～50 Hz，应力1.0%，测定温度25 ℃。

1.3.5 乳液粒径及Zeta电位

采用后向散射动态光散射法，在25 ℃分析复合物的粒径和粒径分布，散射角为173°，根据累积平均粒径，通过Stokes Einstein方程计算粒径。根据多分散指数测量粒度分布，所有样品测定3 次。

将样品添加到配备有电极的反应杯中，温度保持在25 ℃，测定Zeta电位。

1.3.6 Pickering乳液稳定性

利用光学显微镜，在40 倍物镜下观察乳滴形态[15]。

1.3.6.1 离心稳定性

取乳液40 mL于离心管中，以5 000 r/min离心10 min后取出，观察并记录乳液表面出油及分层情况。

1.3.6.2 冷藏稳定性

取10 mL乳液置刻度离心管中，加盖密封，保持直立状态置4 ℃冰箱中冷藏。20 d后观察并记录乳液表面出油及分层情况。

1.3.6.3 冷冻稳定性

取10 mL乳液置刻度离心管中，加盖密封，保持直立状态置-20 ℃冰箱中冷冻保存。每隔一段时间观察并记录乳液表面出油及分层情况。

1.3.6.4 pH值稳定性

取乳液5 mL于刻度离心管中，分别加入5 mL pH 4.0、7.0、10.0的HCl或NaOH溶液，搅拌混匀，加盖密封，室温贮存。20 d后观察记录乳液表面出油及分层情况。

1.3.6.5 盐离子稳定性

取乳液5 mL于刻度离心管中，分别加入5 mL浓度为0、100、200、300 mmol/L的NaCl溶液中，搅拌混匀，加盖密封，室温下贮存。每隔一段时间观察并记录乳液表面出油及分层情况。

1.3.6.6 热稳定性

取乳液10 mL于试管中，加盖密封，将试管分别置于30、60、90 ℃水浴锅中加热，12 h后观察并记录乳液表面出油及分层情况。

1.3.6.7 常温贮存稳定性

取乳液各10 mL于离心管中，于室温静置，20 d后观察并记录乳液外观分层及表面出油情况。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

蛋白质-多糖-酚类复合物的结合程度决定其表面湿润性，表面湿润性增强能够进一步提升界面性能，促进油滴在界面吸附和积累，有助于形成稳定的Pickering乳液[16]。因此选取pH值、温度、没食子酸含量作为指标进行单因素试验，对复合物制备条件进行优化，利用600 nm波长处的吸光度对复合物结合程度进行表征，结果如图1所示。

由图1A可知，随着pH值升高，复合物的吸光度呈上升趋势，在pH 3.5时达到最大，为2.982±0.001，此时pH值小于蛋白质等电点，大豆分离蛋白和没食子酸均带正电荷，溶液中离子携带的正负电荷数接近平衡，形成紧密的静电复合物[17]；当pH值继续升高，吸光度略下降，此时大豆分离蛋白溶液整体带负电荷，只有少部分官能团及没食子酸与果胶静电吸引[18]。由图1B可知，25～35 ℃时，随温度升高，吸光度逐渐上升，最高可达2.861±0.004，这是由于在一定范围内蛋白质溶解度随温度上升而升高，体系中正电荷增多，使结合反应的激烈程度升高[19]；但温度继续升高会导致蛋白质二级结构发生改变，复合物稳定性降低，从而使结合常数变小[20]。由图1C可知，在一定范围内随着没食子酸含量的升高，溶液的吸光度逐渐增大，当没食子酸含量高于40 mg时，继续升高没食子酸含量溶液吸光度无显著改变（P＞0.05），这说明溶液中没食子酸含量达到40 mg后，复合物形成趋于稳定，反应的激烈程度趋于平缓，不再生成新的复合物，此时溶液的吸光度为2.888±0.000。

图1 pH值（A）、温度（B）、没食子酸含量（C）对吸光度的影响Fig. 1 Effect of pH (A), temperature (B) and gallic acid content (C) on the absorbance of the complex

2.2 正交试验结果分析

以单因素试验为基础，设计3因素3水平正交试验，结果如表2所示，通过极差分析，各因素对溶液吸光度的影响大小为pH值＞温度＞没食子酸含量；最优组合为A3B2C2，即pH 4.5、温度35 ℃、没食子酸含量40 mg，此条件下吸光度为3.082。

表2 复合物正交试验方案与结果Table 2 Orthogonal array design and experimental results

2.3 扫描电镜分析

如图2所示，大豆分离蛋白呈松散的形态分布，不能形成网络结构；而大豆分离蛋白-高酯柑橘果胶-没食子酸复合物呈聚合的均匀网络结构，表明本研究中高酯柑橘果胶和没食子酸能与大豆分离蛋白结合形成紧密的复合物，从而改变大豆分离蛋白的微观结构。李春翼等[21]对麦醇溶蛋白-芦丁复合物的微观结构进行表征，研究发现复合物致密多孔，呈现蜂窝状，并且复合物表现出良好的乳化性及乳化稳定性。

图2 大豆分离蛋白（A、B）和大豆分离蛋白-高酯柑橘果胶-没食子酸复合物（C、D）微观结构Fig. 2 Microstructure of SPI (A, B) and SPI-HMCP-GA complex (C, D)

2.4 流变特性分析

对不同油相体积分数的Pickering乳液进行动态黏弹性分析，得到结果如图3所示。由图3A可知，随着剪切频率的增加，储能模量（G’）均高于损耗模量（G”），且呈现出明显的频率依赖性。随着油相体积分数的增加，G’和G”整体呈上升趋势，油相体积分数为0.7时达到最大，说明当油相体积分数达到0.7时，乳液的弹性和黏性最好，形成的凝胶网络结构更强，具有更高的稳定性。通过G’及G”计算得到损耗角正切值（tanδ），如图3B所示，随着频率的升高，tanδ呈现降低后升高的趋势，Zhu Cuiping等[22]研究发现乳清分离蛋白-低甲氧基果胶复合乳液的tanδ呈规律性下降，表明弹性相对于黏性在变强，因此本研究中乳液的弹性先升高后降低，而黏性则先降低后升高，当油相体积分数不高于0.5时更为明显。tanδ始终小于1，说明乳液的G’始终小于G”，乳液呈现类似于固体的形态，表现出典型的弱凝胶黏弹性行为[23]。此外，tanδ与油相体积分数呈负相关，Zhang Chen等[24]对果胶-纤维素复合乳液的研究结果表明，tanδ越小，体系显示出更具有弹性的流体性质，这说明乳液油相体积分数越大，凝胶的三维网状结构越强，在油相体积分数为0.7时基本达到稳定。

图3 Pickering乳液的G’、G”（A）及tanδ（B）变化Fig. 3 Frequency-dependent changes in G’, G” (A) and tanδ (B) of Pickering emulsion

2.5 粒径及Zeta电位分析

乳液粒径越小，乳析速率越慢，则乳液稳定性越强[25]。对不同油相体积分数的复合乳液平均粒径进行表征，结果如图4A所示，当油相体积分数为0.4时，乳液平均粒径为（343.08±6.29）nm，随着油相体积分数升高，乳液平均粒径呈显著降低趋势（P＜0.05），当油相体积分数达到0.7时趋于稳定，不再降低（P＞0.05），此时乳液的平均粒径为（220.36±7.13）nm。这是由于茶籽油中含有大量表面活性物质，油相体积分数增大有助于增强乳液的分散程度，使油滴分散成更小的颗粒[26]，因此油相体积分数越大，乳液越稳定，当油相体积分数达到0.7时，乳液稳定性基本达到最大。

Pickering乳液颗粒间的排斥力决定乳液稳定性，Zeta电位的绝对值越大，说明分子间静电斥力越大，液滴之间不容易絮凝，乳液稳定性则越高[27]。对不同油相体积分数制备的Pinkering乳液的Zeta电位进行分析，结果如图4B所示，不同油相体积分数制备的乳液均表现出强静电斥力，且随着油相体积分数的增大，乳液的Zeta电位绝对值由（36.56±0.93）mV逐渐增加至（55.49±7.97）mV，这说明分子间的静电斥力增大，乳液稳定性升高；而当油相体积分数不低于0.7时，颗粒电位趋于稳定，不再发生显著改变（P＞0.05），这说明当油相体积分数达到0.7时，乳液较稳定，继续升高油相体积分数，乳液稳定性不再发生明显变化，与对乳液平均粒径的研究结果一致。

图4 油相体积分数对平均粒径（A）及Zeta电位（B）的影响Fig. 4 Effect of oil phase volume fraction (φ) on average particle size (A) and zeta potential (B)

2.6 Pickering乳液稳定性分析

复合物在一定的温度、pH值、时间、离子强度等条件下产生协同增效作用，对Pickering乳液的稳定性也有一定影响[28]，通过对乳液微观形态结构进行研究，可以得到其在不同条件下的物理性能及乳化稳定性等一系列指标。

2.6.1 离心稳定性

复合物与茶籽油混合并进行高速剪切乳化后均未出现析乳、析油现象，制得的Pickering乳液为W/O型的均一乳液，乳液质量较好。将5种乳液离心并对其离心稳定性进行探究，结果如图5所示，5种乳液均未出现析油现象，但表现出一定的析乳现象，这是由于离心加速了乳液乳化过程，迫使液滴浓缩，多余的水分会被分离，造成析乳[29]。此外，随着油相体积分数升高，析乳现象逐渐减弱，表明乳液稳定性随油相体积分数的升高而逐渐升高。Wang Lijuan等[29]对玉米醇溶蛋白-壳聚糖复合乳液进行研究，经离心同样出现析乳现象，离心过程中均未出现乳液破碎现象，乳液具有抵抗离心引力的应力，说明本研究的Pickering乳液具有较高的稳定性。

图5 不同油相体积分数的Pickering乳液离心后状态Fig. 5 Effect of oil phase volume fraction on centrifugal stability of Pickering emulsion

2.6.2 冷藏及常温贮存稳定性分析

冷藏及常温贮存对不同油相体积分数的Pickering乳液稳定性的影响如图6所示，随着油相体积分数升高，乳液中油滴的粒径逐渐减小，与2.5节中对乳液平均粒径的研究结果相同，说明随着油相体积分数升高，乳液稳定性逐渐增强。

经过4 ℃及25 ℃贮存20 d后，5 组乳液均未出现析油现象，说明乳液W/O组织结构稳定。冷藏条件下油相体积分数为0.4的乳液出现明显析乳现象，其余组分析乳现象不明显，说明油相体积分数为0.4时乳液稳定性较弱；而常温贮存条件下，所有组分均出现明显析乳现象，且随着油相体积分数的升高，析乳现象明显降低，说明乳液稳定性呈现升高趋势。两种贮存条件下的微观形态结构相似，在油相体积分数低于0.7时，一部分组分虽未出现明显的析油、析乳现象，但微观形态结构分析结果表明乳液粒径明显增大，乳液稳定性下降；而油相体积分数不小于0.7的两组贮存前后粒径及分布无明显变化，说明此条件下乳液稳定性更强。此外，与25 ℃常温贮存相比，4 ℃冷藏条件下析乳现象更弱，油滴粒径变化更小，不容易出现油滴分布不均的现象，这可能是由于常温条件下更适宜微生物生长繁殖而对营养物质（蛋白质、多糖等）造成破坏，从而破坏乳液结构[30]，说明乳液更适宜在4 ℃条件下贮存。

2.6.3 热稳定性分析

在不同热处理条件下的乳液稳定性的结果如图7所示，所有组分均未出现明显的析油情况，说明乳液W/O结构稳定；加热条件下只有油相体积分数为0.4时出现较明显的析乳现象，这是由于此时乳液中复合溶液体积分数较大，致使含水量较高而导致[13]；此外，随热处理温度升高，析乳情况逐渐强烈，说明乳液稳定性被进一步降低。

对乳液微观形态结构进行观察得到类似结果，油相体积分数越大，乳液粒径越小，液滴密度越大，大小均一，乳液稳定性强；而随着温度升高，乳液粒径有明显的增大趋势，且分布的均一性减弱，乳液稳定性降低；相比之下，油相体积分数为0.7和0.8时，液滴粒径随温度变化不明显，乳液稳定性更强。

图6 不同油相体积分数的Pickering乳液常温储藏及冷藏20 d后的微观形态（×40）Fig. 6 Microstructure of Pickering emulsion with different oil phase volume fractions after 20 days of storage at cold and ambient temperature (× 40)

图7 不同油相体积分数的Pickering乳液热处理后的微观形态（×40）Fig. 7 Micromorphology of Pickering emulsion with different oil phase volume fractions after heat treatment (× 40)

图8 不同油相体积分数的Pickering乳液冷冻后的微观形态（×40）Fig. 8 Micromorphology of Pickering emulsion with different oil phase volume fractions after freezing (× 40)

2.6.4 冷冻稳定性分析

冷冻条件对Pickering乳液稳定性的影响如图8所示。冷冻后所有乳液均出现不同程度的析油现象，随着油相体积分数升高和冷冻时间的延长，析油程度逐渐增强，乳液呈现絮状，这可能是由于长时间的低温环境破坏了大豆分离蛋白-高酯柑橘果胶-没食子酸复合物结构，使液滴外层的界面层遭到破坏，油脂被释放而导致[31]。

微观形态结构分析结果表明，冷冻10 d后的乳液液滴发生明显聚集，乳滴粒径增大，乳液稳定性明显下降；且随着油相体积分数升高和冷冻时间的延长液滴粒径逐渐增大，这是由于界面层较薄，油滴絮凝并聚集导致[13]。总而言之，乳液不适宜冷冻贮存，长期低温环境会大大降低乳液稳定性，从而导致乳液质量下降。

2.6.5 pH值稳定性分析

不同pH值条件下的Pickering乳液贮存后的形态结构如图9所示。乳液制备后的24 h内未出现明显的分层现象，乳液不发生聚集行为，说明乳液在短时间内能够保持稳定。贮存20 d的乳液分层现象逐渐明显，乳液发生聚集，并存在不同程度的析乳行为，其中油相体积分数为0.4时，析乳情况最明显，这是由复合溶液体积分数大而导致；随着油相体积分数的升高，析乳情况逐渐减弱，当油相体积分数为0.8时几乎不发生析乳。但在不同pH值条件下，析油情况不同，pH 4时未出现析油现象；pH 7～10时出现较明显的析油现象，且随着pH值升高，析油现象逐渐明显，这说明此时油滴的组织结构遭到了强烈破坏，乳液稳定性仍旧会降低。

对贮存20 d的乳液进行微观形态结构表征，可以看出，油相体积分数和pH值均对乳液稳定性有较大影响。相比较下，pH 4时乳滴粒径总体较小，这是由于此时接近大豆分离蛋白的等电点，大豆分离蛋白与高酯柑橘果胶分子静电互斥作用强烈，乳液较稳定[32]。此外，乳滴粒径总体随油相体积分数升高而逐渐减小，当pH 4、油相体积分数为0.8时，乳滴粒径最小，且分布相对均匀，说明此时乳液最稳定；而pH 7～10、油相体积分数为0.8时，乳滴的结构遭到破坏，乳液稳定性减弱，这可能是由于大豆分离蛋白与高酯柑橘果胶结合程度下降，W/O组织结构遭到破坏而导致[33]。

图9 不同pH值条件下贮存20 d的Pickering乳液微观形态（×40）Fig. 9 Microstructure of Pickering emulsion after 20 days of storage under different pH conditions (× 40)

图10 不同浓度NaCl溶液中贮存的Pickering乳液微观形态（×40）Fig. 10 Micromorphology of Pickering emulsion stored in different concentrations of NaCl solution (× 40)

2.6.6 盐离子稳定性分析

Narululla等[34]报道聚丙烯酸-丹尼酸复合物会在一定NaCl浓度下产生聚集，从而对乳液稳定性产生一定影响。不同浓度NaCl溶液处理的Pickering乳液微观形态如图10所示，所有组分均未出现析油现象，说明盐离子不会破坏大豆分离蛋白-高酯柑橘果胶-没食子酸构成的界面层，油滴被固定在界面层内；油相体积分数低于0.6时出现较明显的析乳情况，且与未添加NaCl溶液相比，添加NaCl溶液的组分析乳情况更明显，说明盐离子环境会降低乳液稳定性。

对乳液微观形态进行观察，得到随油相体积分数增加，乳液粒径逐渐降低，说明增加油相体积分数有利于维持乳液稳定性；而与未添加NaCl溶液相比，添加NaCl溶液后的乳液明显出现聚集，随NaCl浓度升高，聚集情况逐渐明显，这可能是由于大豆分离蛋白在盐溶液中出现轻微盐析，降低分子间静电斥力，复合物结合的紧密程度下降，乳滴逐渐聚集而导致[33]。因此，盐离子浓度升高会降低乳液稳定性。

3 结 论

大豆分离蛋白-高酯柑橘果胶-没食子酸在pH 4.5、温度35 ℃、没食子酸含量40 mg时的吸光度为3.082，呈均匀、致密的三维网状结构，能够形成较为紧密的复合物；油相体积分数为0.7时，G’和G”最大，tanδ最小，乳液形成的凝胶网络结构最强，此时电位为（―54.08±2.74）mV，平均粒径为（220.36±7.13）nm，乳液稳定性相对较强；不同条件下贮存的乳液稳定性各不相同，Pickering乳液在25 ℃常温贮存和4 ℃冷藏相比，4 ℃冷藏条件下析乳现象更弱，油滴粒径变化更小，不容易出现油滴分布不均的现象，更有利于维持乳液稳定性；而在冷冻条件下贮存的乳液随着油相体积分数升高和冷冻时间的延长液滴粒径逐渐增大，长期低温环境会大大降低乳液稳定性，从而导致乳液质量下降。当乳液体系pH值接近4时，乳滴粒径最小，分布相对均匀；高浓度盐离子会破坏复合物结合的紧密程度，液滴发生聚集，乳液析乳情况明显，稳定性下降。本研究可为蛋白-多糖-多酚复合物及其Pickering乳液制备提供理论依据，为其在食品工业中的应用提供参考。