南文华，吴权明*，张瑞平，王 蕊，孙 佩，张培风，赵彦峰，李合顺，王学军，刘文静

(1.西北农林科技大学，陕西咸阳 712100；2.新乡市农业科学院，河南新乡 453000；3.陕西省种子工作总站，陕西西安 710000)

玉米是我国主要粮食，可用于动物饲料和工业原料等方面，是具有多元用途的作物[1-2]。同时，玉米也是世界上最早且最充分利用杂种优势进行生产的作物之一，国内目前90%以上的玉米生产用种是单交种[3]。玉米产量的提高主要得益于杂种优势利用及优良杂交种的普及[4]。玉米杂交种和亲本遗传真实性是种子质量的重要标志之一，直接影响着玉米生产的产量和质量[5]。因此，对玉米杂交种的真实性和纯度能够快速、准确、有效地进行鉴定十分必要。但是，随着国内种质资源的相互渗透，遗传基础趋于狭窄，导致玉米新品种性状表型相似，在大田基础上很难区分[6]。因此，寻求一种操作简单、省时省力，不受环境影响且结果可靠的方法非常必要[7-8]。SSR分子标记技术的发展为玉米杂交种真实性鉴定提供了新的技术手段。SSR作为一种共显性标记，具有多态性好、重复性高、安全高效及覆盖整个基因组的特点[9]，已广泛应用于玉米杂交种真实性鉴定中。王凤格等[10]利用筛选出的40对SSR玉米核心引物对3 998份我国审定的玉米品种建立了DNA指纹库[11]；王蕾等[12]利用17对SSR引物构建了32份黄瓜品种的指纹图谱；尹祥佳等[13]利用SSR技术与筛选出的引物鉴定玉米杂交种豫玉22的纯度；陈国立等[14]用筛选出的7对引物构建了玉米杂交种北青340及其亲本的指纹图谱；李超等[15]利用SSR标记构建了西州蜜系列甜瓜指纹图谱。此外，SSR分子标记技术还在甜菜[16]、青花菜[17]、食用黄花菜[18]、马铃薯[19]、棉花[20]、金银花[21]、桃子[22]、辣椒[23]等多种作物的指纹图谱构建、遗传多样性分析及纯度鉴定等方面发挥作用。

农科大8号是西北农林科技大学与杨凌三泰种业有限公司合作培育的品种，父本是F19，母本是F33。农科大8号2012年通过陕西省审定，审定编号是陕审玉2012022号。笔者利用SSR分子标记技术，用40对玉米核心引物，对农科大8号及其亲本进行分析，根据SSR分子标记共显性的原理[24]，筛选出带型互补清晰、且稳定性、重复性好的引物，用来构建农科大8号及其亲本的指纹图谱。同时，根据在相同位置条带的“有”和“无”分别用“1”和“0”表示，将指纹图谱数字化，计算出现相同指纹的概率，以期为快速有效鉴定市场流通的玉米杂交种农科大8号的真实性提供鉴定手段和参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂玉米杂交种农科大8号及其亲本由西北农林科技大学提供，40对玉米核心引物序列来自玉米基因数据库(http：//www.maizegbd.org/ssr.php)，并由上海生物工程股份有限公司合成。提取DNA所用CTAB、PCR扩增所需2×PCRMix，以及电泳所用硼酸、EDTA、丙烯酰胺等药品均购自上海生物工程有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1DNA提取。将农科大8号及其亲本的种子沙培，于光照培养箱中28 ℃暗培养，等玉米叶片长至约10 cm左右时，取至少20株玉米单株的叶片，用CTAB方法分别提取总DNA[25]，加200 μL TE缓冲液溶解，用1%浓度琼脂糖，于平板电泳槽检测DNA质量，PCR扩增前可适当稀释，4 ℃保存备用，-20 ℃长期保存。

1.2.2PCR扩增及电泳分析。PCR扩增反应总体积15 μL，2×PCR Mix 7.5 μL，DNA 1.0 μL，引物1.0 μL，用灭菌双蒸水补足体积。扩增程序为：94 ℃预变性6 min，94 ℃ 40 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 45 s，35个循环，72 ℃延伸10 min[26]。

在扩增产物中加入1 μL 6×上样缓冲液，于8.0%非变性聚丙烯酰胺凝胶上样2 μL，电压150 V电泳，进行分离检测。最后用银染显色，相机拍照保存并分析图片。

1.2.3指纹图谱构建及数字化。根据电泳结果图，筛选带型清晰，且亲本条带互补的引物，用来构建农科大8号及其亲本的指纹图谱。同时，用数字“1”和“0”将指纹图谱数字化。“1”和“0”分别代表在相同迁移位置条带的“有”和“无”2种情况。根据公式P=1/2n计算出现相同指纹图谱的概率[5，27]。

2 结果与分析

2.1 SSR引物筛选根据40对玉米核心引物对农科大8号及其亲本DNA扩增的结果，从中筛选出8对条带清晰、亲本条带互补的引物，用来构建农科大8号及其亲本的指纹图谱。这8对引物分别为phi053k2，bnlg2291k4，bnlg2305k4，umc1147y4，bnlg1520k1，umc1489y3，bnlg490y4，umc1936k4(表1)，均分布于6条染色体上，共检测出17个等位基因，每对引物检测出2～3个等位基因，平均2.125个，片段大小在100～400 bp。

表1 用于构建农科大8号及其亲本指纹图谱引物信息

2.2 农科大8号及其亲本指纹图谱构建图1是筛选出的8对引物(phi053k2，bnlg2291k4，bnlg2305k4，umc1147y4，bnlg1520k1，umc1489y3，bnlg490y4，umc1936k4)所构建的农科大8号及其亲本的指纹图谱。从图1可以看出，这些引物所扩增的农科大8号及其亲本的带型稳定、清晰，且SSR分子标记是共显性的遗传[28]，因此，农科大8号父母本条带是互补的。

注：M.Mark；父.父本F33;H.杂交种农科大8号；母.母本F19Note：M. Mark; Father. Male parent F33; H.Hybrid Nongkeda No.8; Mother.Female parent F19图1 部分SSR引物所构建的玉米杂交种农科大8号及其亲本指纹图谱Fig.1 Partial PCR amplification product electrophoresis of hybrid Nongkeda No.8 and its parents identified by SSR primers

2.3 农科大8号及其亲本指纹图谱数字化由表2可知，出现与农科大8号及其亲本相同指纹图谱的概率是7.63×10-6，概率极低，由此可推断由这8对引物构建的农科大8号及其亲本的指纹图谱是独一无二的。证明该研究所筛选出的这8对引物构建的指纹图谱可用于农科大8号的真实性鉴定。

表2 农科大8号及其亲本的数字化指纹

3 讨论

玉米作为我国重要的粮饲作物[28]，其安全性和真实性不容忽视。目前商业化育种已成为玉米育种的主要方式，玉米新品种以井喷式涌现[29]。而玉米种子的生产和销售蕴含着巨大的经济利润，使得种子市场中的侵权现象严重[30]。玉米杂交种的保护和真实性鉴定变得极为重要。

SSR分子标记多态性极为丰富[31]，特别适合对玉米进行研究[2]，并且在玉米真实性、差异性以及遗传多样性等方面有很多成功的例子。战超等[32]利用SSR分子标记技术对玉米自交系聚类及同源性进行分析，张华生等[2]利用SSR标记对玉米的特异性进行分析，张瑞平等[26]利用SSR标记构建玉米杂交种指纹图谱等。SSR标记技术在玉米研究中被广泛应用，可操作性强，结果可靠。

该研究利用SSR分子标记技术构建农科大8号及其亲本的指纹图谱，并将指纹图谱数字化，计算出现相同指纹图谱的概率是7.63×10-6，这个概率是极低的，更加客观和直接地证明该研究筛选出的8对引物所构建的农科大8号及其亲本的指纹图谱是特有的，是可以用于鉴定农科8号的真实性的。在生产实践中可从这8对引物中任选2～3对，用来鉴定市场流通的农科大8号的真实性，操作简单易行，结果高效可靠，值得在生产实践中应用推广。