胡琪 侯玉翔 李璿 李梅兰

（山西农业大学园艺学院，晋中 030800）

普通白菜（Brassica rapassp.chinensisMakino）又称青菜、油菜，属十字花科芸薹属芸薹种，含较多蛋白质、维生素等成分，营养价值较高，在全国南北各地均广泛栽培［1］。白菜是种子春化型蔬菜，春季容易先期抽薹，因此，研究植物的开花机制具有重要的实践价值。

植物开花是由内源激素和外部环境信号共同作用的结果，已知的五大类生长激素包括赤霉素、生长素、脱落酸、乙烯和细胞分裂素，均与春化作用和成花诱导有关［2］，其中生长素（IAA）属于生长促进剂，对植物的生长发育具有调控作用［3］。植物体内IAA 的合成非常复杂［4］，其生物合成途径主要分为依赖色氨酸和非依赖色氨酸2 条途径。根据合成的中间产物，依赖色氨酸途径又分为4 条支路，吲哚乙醛肟途径［5］、色胺途径［6］、吲哚乙酰胺途径［7］和吲哚丙酮酸途径［8］。吲哚乙醛肟途径是芸薹属植物中最重要的一条途径［9］，又称为CYP79B 途径。CYP79B2 可以催化色氨酸转化形成吲哚乙醛肟，而吲哚乙醛肟是IAA 和吲哚族硫苷的共同前体物［10-11］。Mikkelsen 等［12］发现经1 μmol/L 2，4-D 处理的拟南芥CYP79B2被诱导表达，导致吲哚硫苷积累量增加。杨子琴等［13］发现阻断龙眼顶芽IAA 的运输可导致延迟开花，而IAA 浓度较低时可促进开花。Hull 等［14］发现拟南芥CYP79B2可以将色氨酸转化为吲哚-3-乙醛肟，且过表达CYP79B2拟南芥产生抵抗毒性的色氨酸类似物，表明CYP79B2可能与植物的防御机制和逆境胁迫有关。另有研究表明，CYP79B2在不同植物生长发育各阶段的表达模式既有相似性又有特异性，在菘蓝和大白菜中，经茉莉酸甲酯胁迫，CYP79B2表达增强，但经水杨酸胁迫后，其表达趋势相反［15-16］。王梦雨［17］还发现BoaCYP79B2和BoaCYP79B3的表达量与芥子油苷的含量密切相关，表明CYP79B2在植物体内具有抗癌防癌的作用。

CYP 酶是一类膜蛋白超家族酶系［18］。目前，在拟南芥、油菜、西兰花等植物中已经克隆到CYP79家族中的多个基因，如CYP79A、CYP79B、CYP79D和CYP79F等［19-22］。前期研究主要阐明了CYP79 在植物生长素合成及其对害虫、病原菌的防御机制中发挥重要的作用。除此之外，宋延宇等［23］发现调控薹菜CYP79B5的表达能改善蔬菜的风味品质。何荟如等［24］发现茶树CYP79A1的表达量与品种和摇青程度有关。由此可见，CYP 酶几乎是“万能的生物催化剂”。但前人的研究多集中在生物合成关键酶的表达调控，如硫苷［25］的合成，以及参与多种乙醛肟类化合物的反应调控，如吲哚乙醛肟［26］的转化。而有关CYP79B2在普通白菜开花调控中的研究却鲜有报道。

本研究以普通白菜品系‘75#’为试验材料，通过RT-PCR 方法克隆普通白菜中生长素CYP79B2同源基因，利用生物信息学方法对其序列及蛋白结构进行分析，运用RT-qPCR 方法分析该基因在不同组织和不同时期的表达情况，以期为后续普通白菜开花调控的基因功能验证提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为普通白菜品系‘75#’，在适宜环境下，种子露白后，4℃低温处理20 d 即可完成春化，然后移栽至穴盘，并分别对移栽后0、10、15 和16 d 的植物组织茎尖进行取样，样品分别标记为V0、V10、V15 和V16。取样量为0.1 g，液氮速冻后于-80℃保存备用。

1.2 方法

1.2.1BrcCYP79B2-2的克隆

1.2.1.1 总RNA 的提取和cDNA 的合成 将V10 样品在液氮中迅速研磨成粉末，按照RNAprep Pure Plant Kit（TIANGEN，DP432）试剂盒提取RNA，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit（Perfect Real Time）（TaKaRa，RR037Q）试剂盒将其反转录成cDNA。

1.2.1.2 基因克隆和序列分析 使用大白菜数据库（http://brassicadb.org）查找CYP79B的同源序列，用Primer 5.0 在线软件对基因设计引物（F：5′-ATGTATCTCCTCACAACGCTCCA-3′；R：5′-TTACTTCACCGTCGGATAAAGTTGC-3′）。以1.2.1.1 反转录的cDNA 为模板，使用TaKaRa LA Taq®（TaKaRa：RR02MQ）试剂进行PCR 扩增，其反应体系为Ta-KaRa LA Taq 0.5 μL、LA Taq Buffer II（10×）5 μL、正、反引物以及cDNA 模板各1 μL、无菌水33.5 μL。反应程序为94℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 2 min，共35 个循环；72℃ 5 min，4℃保存。用1%琼脂糖凝胶电泳检测，条带大小正确且无杂带即可进行回收。

将回收的DNA 产物与pUCm-T Vector（PCR Products Cloning Kit Sangon Biotech，B522213）在PCR仪中连接。后转化至大肠杆菌E.coliDH5α Competent Cells 中，挑选阳性克隆进行PCR 验证，送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.2.2 生物信息学分析 使用DNAMAN 软件将测序序列翻译成氨基酸，以NCBI 数据库为基础，进行氨基酸序列多重比对，并构建系统进化树。采用在线工具ProtParam 分析氨基酸的理化性质，再分别使用SOPMA 和Swissmodel 在线软件对蛋白质结构进行有效预测，了解蛋白质的一些功能。

1.2.3 基因的表达分析 为更清楚地了解CYP79B同源基因的功能，对普通白菜‘75#’的根、茎、叶、花蕾和果荚进行取样，用RT-qPCR 方法研究其在不同组织中的表达情况。设计BrcCYP79B2-2的特异性引物序列（F：5′-TTAGGTACGGCGTTGACCAC-3′和R：5′-TCACCGACCATAACCAACGG-3′）。

2 结果

2.1 基因克隆

以cDNA 为模板，进行扩增，获得一条与目的条带大小一致的条带（图1）。经测序验证后，基因长度为1 554 bp，命名普通白菜CYP79B的同源基因为BrcCYP79B2-2。提交序列至GenBank，登录号为OM339440。

图1 BrcCYP79B2-2 的扩增电泳图Fig.1 Amplified electrophoresis of BrcCYP79B2-2

2.2 序列分析及多重比对

使用DNAMAN 软件对BrcCYP79B2-2的氨基酸序列进行分析，结果表明，BrcCYP79B2-2共编码517 个氨基酸。多重序列比对结果（图2）表明，BrcCYP79B2-2编码氨基酸序列同大白菜（Brassica pekinensis）、甘蓝型油菜（Brassica napus）、甘蓝（Brassica oleraceavar.capitata）、芜菁（Brassicarapa）、花椰菜（Brassica oleraceavar.botrytis）、萝卜（Raphanus sativus）和拟南芥（Arabidopsis thaliana）具有较高同源性，同源性分别为99.42%、99.23%、98.84%、99.42%、98.84%、97.10%和93.44%。表明克隆基因确实为普通白菜BrcCYP79B2-2，且该基因在不同变种白菜中，序列高度保守。

图2 不同物种CYP79B2-2 氨基酸序列的多重比对Fig.2 Multiple alignment of CYP79B2-2 amino acid sequences from different species

2.3 蛋白质亲缘关系分析

为进一步了解BrcCYP79B2-2 在不同物种之间的亲缘关系，使用DNAMAN 软件构建系统进化树，与大白菜（Brassica pekinensis）同源性最高，并且同花椰菜（Brassica oleraceavar.botrytis）和甘蓝（Brassica oleraceavar.capitata）同属于一个小分支，与萝卜（Raphanus sativus）、白芥（Sinapis alba）和拟南芥（Arabidopsis thaliana）亲缘关系较近，与番木瓜（Carica papaya）、黄麻（Corchorus capsularis）、茶花（Camellia sinensis）等植物的亲缘关系较远（图3）。

图3 不同物种CYP79B2-2 同源蛋白的系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of CYP79B2-2 homologous proteins from different species

2.4 蛋白质理化性质分析和结构预测

BrcCYP79B2-2编码517 个氨基酸，分子量为58.522 29 kD，其理论等电点为8.71，脂肪指数为88.47，亲水性的平均值为-0.167；带负电荷的残基总数为58，带正电荷的残基总数为64，不稳定性指数（II）为36.99，此蛋白质分类相对稳定。

使用SOPMA 和Swiss model 分别预测蛋白质的二、三级结构，结果（图4）显示，BrcCYP79B2-2二级结构有α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲，主要二级结构是α-螺旋（47%）和无规则卷曲（36.36%）；其三级结构模型与二级结构分析结果吻合。

图4 BrcCYP79B2-2 蛋白质三级结构预测Fig.4 Protein tertiary structure prediction of BrcCYP-79B2-2

2.5 基因表达分析

为了解BrcCYP79B2-2在普通白菜不同组织与不同生育期中的表达模式，分别对根、茎、花蕾和果荚组织部位取材，使用RT-qPCR 方法对BrcCYP79B2-2的表达进行定量分析。结果（图5-A）显示，BrcCYP79B2-2在不同的组织中均有表达，在植物茎中的表达量最低，在花中的表达量较低，而在根中的表达量最高。比较茎尖在不同发育期的表达，发现经低温处理后，BrcCYP79B2-2表达较低，在移栽10 d 后达到顶峰，此时为营养生长期，移栽15 和16 d 后，即花芽即将分化和分化开始时处于相对较低的表达水平，说明该基因对低温处理有响应，在营养生长时期茎尖的表达较高，但是在茎尖分化时下降（图5-B）。

图5 BrcCYP79B2-2 在不同组织的表达和低温处理后不同时期茎尖部位的表达Fig.5 Expressions of BrcCYP79B2-2 in different tissues and in stem tip in different stages after low temperature treatment

3 讨论

本试验利用同源克隆技术成功克隆到普通白菜BrcCYP79B2-2，从蛋白质亲缘关系图来看，普通白菜BrcCYP79B2同源基因所编码的蛋白质与大白菜、拟南芥和萝卜等十字花科亲缘关系较近，而与黄麻、茶花等植物的亲缘关系较远，进一步说明BrcCYP家族基因具有高度保守性。

植物在适宜的外部环境中，生长到一定阶段的时候，其形态结构和生理结构均会发生改变，其中由营养生长到生殖生长的转变过程最为典型［27-28］，这个过程即高等植物的开花过程。白菜在开花过程中，激素调节的作用不可忽视［29］。IAA 是五大激素之一，几乎调控植物生长发育的所有方面，包括形态发生和对环境变化的响应［30］。在拟南芥中CYP79B共鉴别出2 个基因：CYP79B2和CYP79B3，它们都能催化IAA 的合成，可能与植物开花有关。CYP79B2过表达是导致植物体内IAA 升高的原因之一［31］。当它们被敲除后，cyp79b2cyp79b3双突变体则表现出叶片短小，体内生长素水平下降的明显特征［32］。本试验通过RT-qPCR 研究在普通白菜不同器官中的表达情况，结果显示，BrcCYP79B2-2在根中的表达量最高，这与孙夏莉等［33］研究结果一致。BrcCYP79B2-2在不同组织和不同发育期的表达含量不同，同样，原晓龙等［34］研究显示蒜头果实中CYP79的表达量在花谢后1月＞2月＞4月＞3月，也进一步说明生长素在植物体内的表达具有时空特异性。杜海等［35］在研究中发现拟南芥在低温处理后CYP79B2的表达量呈下降趋势，本研究中，茎尖在低温处理后表达降低，与前人在拟南芥中的研究结果相似。另外，茎尖在营养生长期BrcCYP79B2-2的表达量较高，在花芽即将分化和分化时降低，这可能表示植物体内存在一种机制可以降解浓度过高的生长素，来完成花芽分化的过程。

4 结论

从普通白菜中成功克隆到CYP79B2同源基因BrcCYP79B2-2，其编码序列全长为1 554 bp，编码517 个氨基酸，在白菜不同变种中高度保守。BrcCYP79B2-2具有组织特异性，且参与对低温的响应。BrcCYP79B2-2在茎尖不同发育阶段的动态变化，说明其可能具有促进花芽分化的功能。