赵红玉，徐 磊，易可可

（中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，北京 100081）

磷素是地壳中含量较为丰富的非金属元素，它也是植物生长发育所必需的大量元素之一，其高效吸收及利用对于植物正常生长发育至关重要。植物主要通过根系以磷酸盐的形式吸收土壤中的磷素养分。但由于磷酸盐在土壤中易被固定而难以被植物吸收利用，在田间生产过程中，主要是通过大量的加施磷肥来克服其容易固定的特点。尽管磷肥的大量使用极大地促进了作物的产量，但当季施用的磷肥只有15%～30%能被作物吸收利用。这也导致了当前我国大量的耕地总磷含量高，而作物能吸收利用的有效磷含量相对较低。同时，大量的施加磷肥也会引起水体富营养化等环境问题，严重影响到现代农业的可持续发展。近期，Nature有报道指出，与石油资源的不可再生性类似，磷矿石为农用磷肥的主要来源，有可能在50～100年之后消耗殆尽[1]。因此，农业的安全可持续发展要求我们减少磷肥的使用量，这一目标可以通过提高作物自身的磷吸收效率(根系从土壤中吸收磷的能力)和利用效率(磷在作物体内的循环再利用效率)来实现。而要提高作物磷素吸收利用效率，要求我们更加清楚地解析作物吸收利用磷素的分子生理机制。

目前，对于作物中磷素信号调控网络及其调节磷素吸收机制的认识较为完善。其中，调节作物体内磷素信号网络的核心调控因子是一类含有MYBCC结构域的转录因子PHRs (phosphate starvation response)家族蛋白。PHRs主要通过结合下游磷饥饿诱导表达基因启动子区域的P1BS顺式作用元件来调控基因表达[2–3]。如，水稻中的磷信号核心转录因子OsPHR2可以直接结合磷酸盐转运体OsPT2的启动子，进而调控水稻的磷素吸收平衡[4]。而近期的研究发现，一类负调控因子SPX (根据SYG1、Pho81和XPR1命名)家族蛋白也参与了PHR类转录因子响应磷素供应的活性调控[5–6]。如，在水稻中SPX4能负调控磷信号，正常供磷条件下该蛋白会与OsPHR2蛋白结合，阻碍其进入细胞核内并抑制其与下游的磷饥饿诱导表达基因(如高亲和磷酸转运体等)的启动子结合，从而不启动缺磷信号[7]。在低磷胁迫条件下，由于细胞内IP8含量的下降，导致SPX4与PHR2复合体解聚。而解聚的SPX4蛋白与SDEL1和SDEL2两个E3泛素连接酶结合，并被泛素化修饰而降解，最终释放PHR2进入细胞核内从而启动下游的磷饥饿诱导基因的表达，促进水稻磷素吸收能力[8]。因此，SPX蛋白也被认为是植物体内磷素状况的感应器，参与核心转录调节器PHRs蛋白的活性调控。最近的研究发现PHR2能被E3泛素连接酶HRZ2结合，并被泛素化修饰而降解[9]。这些磷信号网络重要调控因子及其降解调控机制的解析能更好地帮助我们理解作物磷素养分高效吸收机制。此外，基于对这些重要调控因子和下游磷酸盐吸收转运体的认知，我们可以非常方便的通过遗传改良提高作物从外界吸收磷素的能力。如，在水稻中增强表达PHRs和磷酸盐转运体PT等蛋白、敲除负调控因子SPXs，都能创制磷素高效吸收，从而提高植株磷含量的水稻种质[6,10]。但真正在田间应用这些基因和调控因子进行作物磷素养分高效改良，目前仍少有成功案例。究其原因，主要是我们对于磷素养分在植株体内循环再利用的认知缺乏。

与作物中对磷素信号调控网络调节磷素吸收分子机制认知较为完善的现状不同，磷素信号调控网络如何介导作物磷素养分体内高效利用，尤其是体内磷素循环再利用的分子生理机制至今仍不清楚。尽管部分参与调节器官间磷素分布的调控因子已经相继被鉴定。如，PHO1是一类SPX-EXS类蛋白，其主要在植物根系的木质部表达，参与根系吸收的磷酸盐在木质部导管的加载。该基因功能丧失的水稻和拟南芥突变体都表现出了地上部磷素含量低的缺陷[11–12]。而PHO2是一类E2 泛素结合酶，能够介导PHO1蛋白的降解，从而影响磷素在地上与地下部间的分配。与之相应，PHO2功能丧失的水稻和拟南芥突变体都表现出地上部磷素高积累的表型[13–15]。但作物体内组织细胞间磷酸盐循环再利用的重要功能基因，如韧皮部磷素回流再利用的重要转运体，至今尚不明确；且老叶片中的磷素如何周转再利用，及其与磷素信号调控网络间的互作机制至今仍不清楚。

导致这种问题的主要原因之一是我们仍缺乏经济高效检测组织细胞磷素分布的技术和方法[16]。目前常见的磷含量化学测定方法都是对植物样品进行破坏性取样后，利用样品中提取的磷酸盐与特殊化合物(如钼酸铵和酒石酸锑钾)特异反应，并在特殊条件下形成带色络合物，从而进行磷素含量的定量测定。这些化学方法受制于取样方法和测定技术，难以原位对植物细胞组织中磷素进行精准测定。后期也有部分技术通过X射线荧光光谱或31P-NMR核磁共振谱等物理原理对植物样品中磷素进行测定或成像。但这类方法都需要采用昂贵的仪器设备，且无法高效地进行组织细胞磷素含量测定。近年来，也有科学家通过利用基于荧光共振能量转移(FRET)原理创制磷酸盐荧光指示蛋白，并利用该类指示蛋白对细胞内磷酸盐含量进行检测和测定。如Sahu等[17]通过利用该类蛋白对拟南芥根系细胞质中的磷酸盐浓度进行了测定，发现根系细胞处于不同发育阶段及外界磷酸盐供应不同时，其细胞质中的磷含量展现出了一定的变异。但这些技术需要创制相应的转基因材料，且需要利用激光共聚焦显微镜进行观察。同时，细胞质内的磷酸盐浓度一般保持在较稳定的水平，主要受到液泡中储存磷酸盐的缓冲。该类技术也不利于我们高效地检测植物细胞内磷酸盐含量的动态变化。因此，为了更好的理解磷素信号调控网络及重要功能基因如何影响体内磷酸盐的循环再利用，我们急需发展高效经济的组织细胞水平磷酸盐检测技术。

液泡磷酸盐的储存和利用对于作物磷素利用效率起着重要作用。在细胞水平，超出细胞代谢所需的磷酸盐由PHT5家族蛋白运输入液泡内储存，作为储备用于缓冲细胞磷素需求[18–19]。而这部分液泡储存的磷酸盐，能够在细胞需要时通过VPE1和VPE2蛋白释放到细胞质中进行利用[20]。且在外界磷素供应不足时，原来储存在液泡中的磷酸盐不仅要释放到胞质中供细胞代谢所需，甚至要调运到新叶中进行再利用。VPE蛋白对于水稻体内磷素再利用起着非常重要的作用，该类基因的突变将导致老叶中的磷素运输到新叶途径受阻。因此，进一步解析PHT5和VPE家族基因协同作用机制，将有利于我们明确液泡磷酸盐储存平衡对于磷素内部再利用的重要作用，并为提高水稻地上部磷素再利用效率提供理论基础和技术。

植物地上部磷素再利用，尤其是老叶中磷素要提供给新叶进行再利用，都需要将磷酸盐通过韧皮部的伴胞细胞加载到筛管细胞，使其随着韧皮部溶液回流供应给其它组织器官。因此，磷酸盐在韧皮部的伴胞细胞加载到筛管细胞的过程对于磷素的再利用起着非常重要的作用。而影响该加载过程的磷酸盐转运体是这一再利用途径的关键基因。但参与调控韧皮部磷素回流再利用的重要转运体，至今尚不清楚。

因此，建立高效经济的植物细胞水平磷酸盐检测技术，并利用该技术解析水稻体内组织细胞间磷酸盐的循环再利用机制，从而为创制磷素高效利用水稻品种提供理论基础和手段。

该项目研究内容与方案：

1)高效经济的植物细胞水平磷酸盐分布检测技术建立和完善：借助不同化学染料，结合植物组织细胞处理及切片等技术，创建高效经济的植物细胞水平磷酸盐分布检测技术。并通过对已报道影响磷素吸收转运重要功能基因相关突变体进行系统检测，进一步验证和完善染色技术系统。

2)水稻磷素内部再利用关键功能基因克隆及其调控转录因子鉴定：结合反向遗传学，借助韧皮部伤流液磷酸盐含量测定等技术，分离并鉴定韧皮部磷酸盐加载重要转运体和参与磷素由老叶到新叶转运的重要功能基因。借助协同表达分析等生物信息学手段，鉴定调控磷素内部再利用关键调控因子，如调节韧皮部磷酸盐加载转运体表达的转录因子基因。

3)水稻磷素内部再利用关键功能基因及其调控转录因子介导植株内磷酸盐分配机制解析：对获得的潜在影响水稻磷素内部再利用的转运体基因及其调控因子相关遗传材料进行功能解析。并借助细胞水平磷酸盐检测技术，对相关遗传材料在不同供磷条件下进行精细分析。

4)磷信号调控网络与磷素内部再利用关键功能基因和调控转录因子的遗传分析：利用实验室长期研究的水稻磷信号调控网络核心调控因子PHR2、SPXs等，通过与鉴定的水稻磷素内部再利用关键调控转录因子进行相关遗传材料杂交，进行遗传分析，并建立相关遗传调控网络。

5)水稻组织细胞间磷酸盐循环再利用的分子生理调控网络构建及应用：结合遗传分析工作结果，选取水稻组织细胞间磷酸盐循环再利用的重要调控因子相关遗传材料进行转录组、ChIP-seq等分析，从而构建相关转录调控网络。同时，结合表型分析，对部分重要节点进行遗传改良，测试相关遗传材料在不同供磷条件下的磷素养分利用效率，并评价其潜在应用前景。