张嘉豪，傅蓉，吴照球

（中国药科大学，江苏 南京 210000）

1 Wnt 信号通路概述

Wnt/β-catenin 信号通路在正常发育、疾病和整个生命过程中都是至关重要的。Wnt 信号调控各种生命过程，如细胞增殖、分化、器官发育、组织再生和肿瘤发生[1,2]。Wnt 信号通路主要分为经 典 通 路( 即Wnt/β-catenin 信 号 通 路) 和 非 经典通路( 如Wnt/planar-cell-polarity-like 通路和Wnt/Ca2+通路)[3]。经典Wnt 信号通路激活依赖于β-catenin，调控T 细胞因子(T-cell factor, TCF)/淋巴增强因子(lymphoid enhancer factor, LEF)靶基因的转录[4]。

Wnt 经典信号通路激活主要依赖于细胞外分泌的Wnt1、Wnt3A 和Wnt8 和七个跨膜受体Frizzled(Fz)及其共受体低密度脂蛋白受体相关蛋白(lowdensity lipoprotein receptor-related protein, LRP) LRP5和LRP6 结合。Wnt 的结合触发了Dishevelled (DVL)支架蛋白的结合激活和LRP5/6 的磷酸化，随后由腺瘤性结肠息肉病蛋白(adenomatous polyposis coli, APC)，轴抑制蛋白(axis inhibition protein, AXIN)，糖原合酶激酶3β (glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)，酪蛋白激酶1 (casein kinase1, CK1) 组成的破坏复合体(destruction complex)失活；在没有Wnt 配体激活的情况下，破坏复合体执行对于关键因子β-catenin 的胞质磷酸化、泛素化和蛋白酶体降解；但Wnt 通路激活状态下，破坏复合体受到扰动或抑制，胞质内游离的β-catenin 逐渐累积并转运至核内。在细胞核中，β-catenin 与TCF/LEF 家族转录因子、组蛋白乙酰转移酶CBP/p300、BCL9 和其他共激活因子结合，激发下游基因的转录，介导细胞增殖、生存与分化[5]。超过120 个下游靶基因已经过鉴定，包括AXIN2, LEF-1 和WNT3A, 这些因子可以进一步通过负反馈方式调节Wnt 信号通路[6]。Wnt 非经典信号通路由其他Wnt 蛋白激活，例如Wnt4、Wnt5A 以及Wnt11，该通路的激活不依赖于β-catenin，并在细胞粘附及细胞迁移中起到重要作用，同时可能伴有其他通路例如Wnt/planarcell-polarity-like (PCP)通路和Wnt/Ca2+通路的共激活[7]。

2 Wnt 信号通路 突变与肿瘤/其他疾病

经典的Wnt 信号通路通过调节细胞增殖、分化、迁移和凋亡，促进胚胎正常发育并维持成年组织稳态。然而，Wnt 信号异常激活在肿瘤细胞增殖、存活、转移以及肿瘤干细胞的维持也扮演着重要的角色[8]。Wnt 信号通路的异常激活主要分为突变 (例如β-catenin 及TCF 的获得性功能突变，负调控因子APC 及AXIN 的功能缺失突变)，非突变(例如细胞外Wnt 拮抗因子的表观遗传沉默)以及Wnt 配体及受体的旁分泌、自分泌异常[9]。

2.1 Wnt 信号通路与肿瘤

结 直 肠 癌(Colorectal cancer, CRC) 是Wnt 信号通路过度激活而引起的癌症代表[10]。结直肠癌患者表现出高频率的APC 突变(～70%)[11-12]。APC突变( 主要为截短型突变) 导致APC 蛋白失去AXIN 及β-catenin 的结合位点，破坏复合体功能丧失，导致β-catenin 在胞质内的累积并入核，介导Wnt 下游靶基因例如cyclin D1 和c-MYC 的激活表达，最后改变细胞周期进程并促进肿瘤发生[13]。CRC 发展还需其他基因的发生突变，例如KRAS,PI3K, TGF-β, SMAD4 以及TP53[14]。此外，在没有APC 突变的情况下，也经常发现Wnt 信号负调控因子的表观遗传沉默[15]。另外，截短突变的APC仍能够结合Asef，持续激活Asef 的GEF 活性并由此活化Cdc42，通过c-Jun N 末端激酶(JNK)途径上调基质金属蛋白酶9 (MMP9)的表达，从而促进癌细胞迁移和血管生成[16]。

与CRC 中APC 基因经常突变不同，编码β-catenin 的CTNNB1 基因主要在肝癌、子宫内膜癌和胰腺癌中存在突变[17-18]。β-Catenin 主要有3 个结构域：N 端～150 个氨基酸，12 个armadillo重复结构域～550 个氨基酸，C 端～100 个氨基酸。在人类癌症中，其N 端的磷酸化位点(Ser/Thr)是CTNNB1 的突变热点[19]，N 端结构域包含GSK3 和CK1 的磷酸化位点[20-21]，通过β-TrcP 介导β-catenin 降解，这表明避免破坏复合体介导的β-catenin 蛋白降解是Wnt 信号诱导肿瘤发生发展的关键过程。

AXIN 是一种多结构域支架蛋白(包括AXIN1和AXIN2)，其 与APC，CK1 和GSK3 共 同 形 成β-catenin 的 毁 灭 复 合 体[22]。AXIN 与APC 能 促进GSK3 与β-catenin 的结合，同时AXIN1 能够促进GSK3 对于β-catenin 的磷酸化[23]。在几种不同的肿瘤中都发现了AXIN1 和AXIN2 的突变，例如结肠癌、卵巢癌、子宫内膜样癌、腺癌和HCC 细胞系，大多数的AXIN 突变存在于APC 结合域(RGS domain) 和β-catenin 结 合 域[24]。生 化 和 功 能 研究表明，这些突变干扰了GSK3 的结合，也改变了AXIN 和两个依赖于TCF 转录的上游激活因子Frat1 和DVL 之间的相互作用[25]。

Wnt 配体的分泌主要依赖于Porcupine (PORCN)的酰化作用[26]，PORCN 是一种膜结合的O-酰基转移酶，介导Wnt 配体的棕榈酰化从而促进其分泌。而PORCN 在各种人类癌症中，包括食道癌、卵巢癌、子宫癌、肺癌和宫颈癌都存在着遗传学改变[27]。另外，Wnt10B 在三阴性乳腺癌中高表达，Wnt7B 在约10%的乳腺癌患者中过表达[28]。Wnt信号通路在50%以上的乳腺癌患者中被过度激活，并与总生存率降低相关[29]。

2.2 Wnt 信号通路与其他疾病

近期的研究表明，Wnt 信号通路异常与肝、肺、肾等组织器官的各种纤维化疾病的发生和进展密切相关[30,31]。研究发现，Fz2, Fz3,Wnt1,Wnt17B,Wnt10B,β-catenin 以及LEF 的表达在肺纤维化患者的肺组织中显著上调[32]。外源性Wnt5a 可促进肝星状细胞(HSC)的增殖。Wnt/β-catenin 信号通路也可以通过激活HSC 参与肝纤维化的形成[33]。

Wnt 信号在某些代谢性疾病中也发挥着重要作用。Wnt 信号通路通过激活TCF/ LEFs，包括过氧化物酶体增殖激活受体γ (PPARγ)和CCAAT/增强结合蛋白α (C/EBPα)，抑制前脂肪细胞中脂肪形成的关键调控因子，从而抑制脂肪形成与肥胖。此外，在体外敲除成年小鼠和人胰岛蛋白中编码TCF7L2 的基因可减少β 细胞增殖和胰岛素分泌34。即使胰岛结构正常，LRP5 的敲除导致胰岛素分泌受损[35]。

3 Wnt 信号通路 靶向药物

Wnt 信号通路的异常激活促进了肿瘤及其他疾病的发生发展，并且，Wnt 信号一定程度上介导了肿瘤对传统化疗、放疗、靶向治疗和免疫治疗的耐药性[36]。因此，靶向Wnt 信号通路有望治疗多种人类癌症，同时以抗Wnt 信号为基础的联合疗法是克服获得性耐药的独特手段[37]。

对于Wnt 信号通路靶向药物的发现和发展，学术界和工业界贡献了巨大努力[38,39]。多样的靶向手段，包括小分子化合物、肽段类、抗体类药物，经历了一定程度的发展，并已处于不同的临床阶段。下面将主要介绍Porcupine 抑制剂、Tankyrase 抑制剂和β-catenin-蛋白互作抑制剂等Wnt 信号通路抑制剂的研究进展。

3.1 Porcupine 抑制剂

Porcupine 是一种膜结合O- 酰基转移酶(MBOAT)，可以在内质网中将Wnt 配体酰化(添加单不饱和脂肪酸)。这种翻译后的棕榈酰化对Wnt 配体与FZD 受体的分泌和结合至关重要[40,41]。Porcupine 活性降低会导致发育障碍，而Porcupine活性过高则可能导致癌细胞生长[42,43]。Porcupine在各种人类癌细胞和组织(如肺癌组织)中过表达，但在正常细胞中不存在过表达[44]。Porcupine mRNA 水平的下调可导致肺癌细胞Wnt 通路活性降低并促进凋亡。因此，Porcupine 是开发Wnt 通路有效抑制剂的一个潜在靶标[45]。

IWPs 是一种Porcupine 的小分子抑制剂，由Chen Chuo 等人首次报道[46]。IWP-1 和IWP-2 的抑制活性可达到纳摩尔级水平，IC50 值分别为60 nM 和27 nM。后来，他们把这两种化合物作为先导化合物，生成了IWP-L6 (IC50= 0.5 nM)，经过结构优化后具有较好的活性。虽然该化合物在人血浆中具有一定的稳定性，但在大鼠和小鼠血浆中的代谢稳定性较差。

LGK974 是诺华公司开发的一种Porcupine 小分子抑制剂，具有良好的抑制活性，且其对19 种Wnt 配体均有抑制作用( 例如, Wnt1、-2、-3、-3A、-6、-7A 和-9A)[47]，比IWP 系列化合物更具优势。该化合物在细胞实验中IC50 为0.38 nM，可有效抑制Wnt 信号通路中LRP6 受体的磷酸化以及Wnt 下游相关靶基因的表达(例如AXIN2)。在MMTV 驱动的Wnt1 肿瘤模型和头颈部鳞状细胞癌(HNSCC) 模型中，当口服剂量为3mg/kg时，LGK974 能有效抑制肿瘤生长，但当剂量增加到20mg/kg，出现肠道毒性。说明在一定剂量下，LGK974 对肿瘤有治疗作用的同时，也能维持正常组织Wnt 信号通路。目前，该化合物进入了Wnt配体依赖性恶性肿瘤的I/II 期临床试验，也是首个进入临床研究的Porcupine 小分子抑制剂。

2015 年Keller 等通过高通量筛选获得Porcupine小分子抑制剂ETC131 和ETC159[48]，它们的IC50分别为0.5 nM 和2.9 nM。ETC159 能够抑制Wnt/β-catenin 基因报告基因活性，抑制Wnt3A 分泌和棕榈酰化，促进β-catenin 降解。在MMTV 驱动的Wnt1 肿瘤模型中，ETC159 能有效抑制肿瘤生长(肿瘤生长抑制率94%，10mg/kg/day)，降低细胞质中β-catenin 及相关靶基因如Axin2、Tcf7、c-Myc 的表达。ETC159 目前处于I 期临床试验阶段，评估其单独使用/与派姆单抗联合治疗晚期实体肿瘤的安全性和耐受性。

3.2 Tankyrase 抑制剂

端锚聚合酶，Tankyrase1 (TNKS1，又称PARP5a、ARTD5)和Tankyrase2 (TNKS2，又称PARP5b、ARTD6)属于多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶类(poly(ADP-ribose)polymerases,PARP) 家 族[49]。TNKS 蛋 白 包 括 一 个HSP区域(组氨酸、脯氨酸和丝氨酸)、锚蛋白(ankyrin,ANK)重复簇(ARC)、介导TNKS 寡聚的sterile alpha motifs (SAM) 和C 端PARP 催化结构域。在Wnt信号通路中，TNKSs 可以促进AXIN 的多ADP 核糖基化-泛素化降解从而抑制β-catenin 的降解，抑制TNKS 可稳定AXIN 从而拮抗Wnt 信号[50]。TNKS 作为一种潜在的抗癌靶点而备受关注，其覆盖的机制多种多样，大多数TNKS 抑制剂与PARP催化结构域结合[51]。

Huang 等人发现了第一个Tankyrase 抑制剂XAV939[50]，与TNKS1/TNKS2 的结合亲和力约为100 nM，与重组PARP1 结合Kd 值为1.2 μM，双敲除实验证实TNKS1 和TNKS2 是化合物的细胞靶标，而不是PARP1。实验研究表明XAV939 通过增加AXIN 蛋白水平，进而促进β-catenin 磷酸化依赖的降解，阻断WNT 信号，抑制APC 缺陷结肠癌细胞的增殖。该团队首次发现Tankyrase 负责AXIN 蛋白重要的PARylation 修饰，并阐明AXIN的新降解途径为PARylation 偶联的泛素化降解，这为靶向Wnt 信号通路提供了另一理论基础。该化合物与TNKS2 PARP 结构域(aa946-1162)共晶结构表明，其占据NAD+结合位点的烟酰胺腔，这和其与PARP1 的复合物相似。

另外，IWR1 是一种可以抑制Wnt 信号的AXIN 稳 定 剂[45]，其 靶 向TNKS1 和TNKS2，IC50值 分 别 为131nM 和56 nM。IWR1 与TNKS2 的共复合物结构表明，它与诱导的腺苷位点结合，而不是与烟酰胺位点结合[51]。这也许可以解释与XAV939 相比，化合物IWR1 对TNKSs 的选择性优于PARP1。服用化合物IWR1 5 mg/kg 对人骨肉瘤小鼠异种移植模型有明显的肿瘤生长抑制作用(71%)[52]。

此外，JW55 是由高通量筛选得到的一个新型的PARP 抑制剂[53]，目前正处于临床前研究。该化合物表现出auto-PARylation 抑制活性，对TNKS1和TNKS2IC50 值为1.9 μM 和830 nM，选择性是PARP1 的10 倍以上。同时，JW55 能够降低APC条件敲除小鼠SW480 结肠癌细胞的生长并减少肠道肿瘤的发生。

虽然Tankyrase 抑制剂已经被证明是有效的，但大多数致病突变导致APC 或Wnt 信号通路破坏复合物失活，这给靶向Tankyrase 的治疗带来局限性。此外，Tankyrase 还参与其他信号通路，这将带来不可预测的脱靶风险。

3.3 β-catenin-蛋白互作抑制剂

β-Catenin 是Wnt 信号通路下游的关键效应因子。Wnt 通路激活可导致细胞核内β-catenin水平升高，β-catenin 与TCF/LEF 和一些辅助因子 如CBP、p300、BCL9、Pygopus 和Brg1 结 合，诱导过表达Wnt 靶基因( 如cyclin D1, c-MYC和survivin) 从而调节细胞增殖、迁移和存活[54]。β-Catenin 的关键效应离不开这些相互作用的蛋白，因此，阻断β-catenin/TCF 蛋白- 蛋白相互作用(PPI) 和β-catenin/ 辅 因 子( 如CBP、BCL9 和p300)相互作用是一种很有前景的治疗方法，具有巨大的治疗潜力[55]。

3.3.1 TCF/β-catenin 互作抑制剂

Wnt 信号通路中存在很多突变，因此很难找到靶向下游效应蛋白的药物。期初，研究人员采用高通量酶联免疫吸附试验对7000 种天然产物和4500种合成化合物中筛选出了8 种化合物[56]。这些化合物可以以剂量依赖的方式干扰TCF/β-catenin 复合物的形成。在这8 个化合物中，PKF115-584 和CGP049090 表现出较好的活性。同时，有证据表明这两种化合物也可以阻断β-catenin 与APC 的结合[57]。但一个明显的缺点是其对于TCF/β-catenin相互作用的抑制存在一定非选择性。

2011 年，Wang 等人报道了一种半合成萜类化合物NC043，该化合物从传统中药绣线菊中提取，用于消炎止痛。实验表明，NC043 通过调节β-catenin/TCF4 转录复合物的形成，有效抑制Wnt下游靶基因的表达。NC043 能在G2/M 期阻断结肠癌细胞增殖，较正常结肠上皮细胞能明显抑制结肠癌细胞的生长[58]。

靶向PPI 的药物发现是具有挑战性的，特别是在蛋白- 蛋白界面高度延展的情况下。最近，通过烃类固定α-螺旋技术从而抑制PPIs 的成功表明拮抗TCF/β-catenin 相互作用成为可能[59,60]。Grossman 等报道了一系列烃类钉肽(StAx peptides)，它 们 直 接 靶 向β-catenin 和TCF 的 相互作用[61]。这种螺旋结构的钉接肽，能有效抑制β-catenin 的转录活性。且α-螺旋钉接技术能提高靶蛋白的结合亲和力，降低蛋白降解速率，并改善细胞摄取。

3.3.2 CBP/β-catenin 互作抑制剂

环AMP 响应元件结合蛋白(Cyclic AMP response element-binding protein, CBP)是一种核内共激活因子，作为与β-catenin 结合的辅因子，在转录过程中发挥关键的调节作用，其结合位点不同于TCF/β-catenin[62]。有研究表明，CBP/β-catenin 互作抑制剂可以有效抑制Wnt 相关靶基因的表达和肿瘤细胞的生长[63]。Emami 等人发现了ICG-001 为CBP/ β-catenin 的互作抑制剂，可拮抗β-catenin的转录过程[63]。研究表明，ICG-001 能特异性结合CBP 从而诱导结肠癌细胞凋亡，但对正常结肠上皮细胞无作用。PRI-724 是Prism 和Eisai 联合开发的一种新型CBP/β-catenin 互作抑制剂[64]，这种小分子药物目前处于Ⅱ期临床试验阶段。然而，CBP 是一般的共激活因子，因此这些抑制剂靶向Wnt 信号通路可能缺乏特异性。

3.3.3 BCL9/β-catenin 互作抑制剂

除上述药物类型外，针对BCL9/β-catenin 互作的药物也崭露头角。de la Roche 等人通过高通量筛选发现鼠尾草酸(CA)能在体外以剂量依赖的方式抑制BCL9 与β-catenin 结合。核磁共振研究和分析超速离心表明，结合活性需要一个本质上不稳定的α-螺旋(H1)。CA 可将Wnt 靶基因转录水平降低到40% (AXIN2) 和60% (B9L)[65]。2012年，Takada 等人开发了一种稳定的BCL9 α - 螺旋(SAH-BCL9)，以β-catenin 为 靶 点，干 扰 天 然BCL9/β-catenin 复合物的形成。钉接螺旋结构在体外表现出更高的α-螺旋度、β-catenin 结合亲和力和蛋白水解稳定性[66]。

4 总结与展望

Wnt/β-catenin 信号通路的遗传和表观遗传失调控促进了人类癌症及其他疾病的发生发展，这也使得靶向Wnt/β-catenin 信号通路的药物逐渐成为潜在治疗方法。尽管如此，Wnt 信号的阻断会破坏正常组织内稳态与再生，尤其在癌症治疗的实践中，其药效和潜在毒性之间的平衡至关重要。同时，Wnt 信号通路本身在疾病中的作用，已牵涉到许多互作因子网络，未来针对Wnt 信号通路的药物发现与临床应用，应关注药物靶向Wnt 信号通路的精确性与选择性，从而为患者提供更明确更精准的治疗方案。