张雪莉，丁艳华，马海乐*，洪 晨，张 涛，唐艳萍

（1 江苏大学食品与生物工程学院 江苏镇江212013 2 湖南新金浩茶油股份有限公司 湖南永州 426100）

油茶籽粕中营养成分丰富，主要含有多糖40%、茶皂素10%～15%、粗蛋白15%、粗脂肪5%以及多种氨基酸，是一种潜在价值很高的饲料原料[1]。茶皂素因溶血作用[2]，而可广泛应用于农作物害虫防治，且无污染、无毒害，耐于储存。茶皂素还是一种性能良好的天然非离子表面活性剂[3]，可广泛应用于日用化工、纺织和食品等行业[4-5]。此外，茶皂素具有杀菌[6]、消炎抗渗[7]以及抗氧化[8]等生物活性。从油茶籽饼粕中提取茶皂素对于提高油茶籽饼粕的经济价值，充分利用油茶籽饼粕资源，具有着重要的现实意义，应用前景十分广阔。

目前，茶皂素含量常用香草醛-浓硫酸显色法测定[9]，也有重量法、色谱法等[10-11]。蛋白质含量检测方法较多，主要有凯式定氮法、lowry 法和杜马斯燃烧法等[12-13]。检测多糖的方法多为苯酚硫酸法和蒽酮硫酸法[14-15]。这些传统检测方法过程繁琐、耗时较长、污染环境，且实际测量的化学值与提取过程之间存在延迟或误差，迫切需要一种连续、快速、准确、环保的方法监测提取过程中的茶皂素质量浓度、蛋白质质量浓度和多糖质量浓度的变化，以确定提取终点。

相较于传统分析技术，近红外光谱技术具有快速、准确、成本低和绿色环保等特点[16-17]。Hua等[18]对茯苓多糖的提取过程进行近红外光谱监测；Tian 等[19]利用近红外光谱和化学计量学技术联合的方法测定全麦粉中的总酚含量。此外，近红外光谱技术也被用于藏红花[20]和牛肉[21]的鉴别和掺假检测。可见，近红外光谱技术已广泛应用于在线和现场监测[22-23]。

本研究应用便携式近红外光谱技术，实时监测茶皂素提取过程中的主要质量参数变化，研究其适用性并选择一种有效的算法建立稳健的预测模型，实现提取过程中对各质量参数的预测，为终点的判断提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

油茶籽饼粕，湖南新金浩茶油股份有限公司；茶皂素标品，北京索莱宝科技有限公司；牛血清白蛋白，上海麦克林生化科技有限公司；香兰素、乙醇和浓硫酸等试剂均为分析纯级。

T-6 新世纪可见分光光度计，北京普析仪器有限公司；NIRQUEST256-2.5 近红外光谱仪、TP300 浸入式光纤探头、DH-2000-BAL UV-VISNIR 光源，美国海洋光学公司；台式高速冷冻离心机，盐城市凯特实验仪器有限公司；HH-4 数显恒温水浴锅，上海力辰邦西仪器科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 提取过程中原位实时光谱采集 近红外原位在线监测提取过程的系统装置图如图1 所示。75%乙醇以料液比1∶10 在60 ℃下提取，每2 min取样一次，共计88 个样品。将所有样品离心（10 000 r/min 离心10 min），收集上清液，放置于-20 ℃保存，待测化学值。光谱采集参数：光谱范围为900～2 500 nm，分辨率为6.4 nm，扫描8 次，光程4 mm。以75%乙醇（60 ℃）作为背景，每个样品重复采集3 次，取其平均值作原始光谱图。

图1 原位实时光谱在线监测茶皂素提取过程装置图Fig.1 Device diagram for in-situ real-time spectroscopy on-line monitoring of tea saponin extraction process

1.2.2 茶皂素质量浓度、蛋白质质量浓度和多糖质量浓度的离线测定 茶皂素质量浓度采用香草醛-浓硫酸显色法测定[24]。蛋白质质量浓度采用lowry 法[12]测定，以牛血清白蛋白作为基准物质作标准曲线。采用苯酚硫酸法[14]测定多糖质量浓度，以干燥的葡萄糖标准品作为基准物质制作标准曲线。提取的茶皂素质量浓度、蛋白质质量浓度和多糖质量浓度均按下式计算：

c=C×N

式中，c——样品质量浓度，mg/mL；C——测定质量浓度，mg/mL；N——稀释倍数。

1.2.3 原位实时光谱预处理 采用标准正态变换（SNV）、多项式卷积平滑（SG）、一阶导数（1stDer）和二阶导数（2ndDer）4 种常见的预处理方法对提取过程中采集的原始光谱进行预处理。采用PLS模型进行预处理方法的对比研究，选取最优的预处理方法。

1.2.4 提取过程原位实时监测定量模型的建立选用Set Partitioning Based On Joint X-Y Distance（SPXY）方法对近红外光谱仪采集的光谱信息进行校正集（66 个）和预测集（22 个）样本的划分，共计88 个样本，如表1 所示。

表1 校正集和预测集中茶皂素、蛋白质和多糖质量浓度的实测值Table 1 Measured values of tea saponin，protein and polysaccharide mass concentrations in correction and prediction set

采用偏最小二乘法（Partial least squares，PLS）、区间偏最小二乘法（Interval partial least squares，ipLS）和联合区间偏最小二乘法（Synergy interval PLS，Si-PLS）进行模型构建，分别筛选出与茶皂素质量浓度、蛋白质质量浓度和多糖质量浓度相关度高、预测及稳健性较好的模型。

1.2.5 数据分析 所有数据处理和分析均在Matlab 2009b中进行。从http：//www.models.kvl.dk/免费下载Si-PLS Matlab 代码。

2 结果与分析

2.1 提取过程中茶皂素质量浓度、蛋白质质量浓度和多糖质量浓度的变化

提取过程中茶皂素质量浓度、蛋白质质量浓度和多糖质量浓度变化如图2 所示，随着提取时间延长，各样品质量浓度虽不断增加，但增长缓慢，呈现波动变化。可以发现，提取过程中，茶皂素提取量最高，多糖及蛋白质提取量较低，可见此提取方法能较大限度的提取较高纯度的茶皂素。同时监测茶皂素、蛋白质和多糖的质量浓度变化，可以更加全面的分析数据并建立模型，对提取中主要物质的变化进行更好的预测。

图2 提取过程中茶皂素、蛋白质和多糖质量浓度变化Fig.2 Off-line measured data of tea saponin，protein and polysaccharide mass concentration during the extraction process

2.2 提取过程中光谱预处理

通过近红外光谱仪采集到茶皂素提取过程中的原始光谱图，选取标准正态变换（SNV）、多项式卷积平滑（SG）、一阶求导（1stDer）和二阶求导（2ndDer）4 种预处理方法对原始光谱进行预处理。4 种预处理方法结合最小二乘法（PLS）对提取过程采集的光谱分别与茶皂素质量浓度、蛋白质质量浓度和多糖质量浓度进行建模，以校正集决定系数（RC）、交叉校验残差均方根误差（RMSECV）和预测集决定系数（Rp）、预测残差均方根误差（RMSEP）为模型评价指标，比较其建模效果从而筛选出最优的预处理方法，结果见表2。由表2 可知，在已构建的光谱信息和茶皂素质量浓度之间的模型中，1stDer 预处理方法建立的校正模型、预测模型的决定系数RC值、Rp值均最大，分别为0.9819 和0.9932，且RMSECV 值、RMSEP 值比较低，分别为1.67 和1.08。在光谱信息和蛋白质质量浓度之间的模型中，1stDer 预处理方法建立的校正模型、预测模型的决定系数RC值、Rp值分别为0.9718 和0.9879，而RMSECV 值、RMSEP 值也较低，分别为0.518 和0.323。已构建的光谱信息和多糖质量浓度之间的模型中，1stDer 预处理方法建立的校正模型、预测模型的决定系数RC值、Rp值也最大，分别为0.9798 和0.9947，RMSECV 值、RMSEP 值较低，分别为0.531 和0.309。因此，与其它3 种预处理方法相比，使用1stDer 预处理方法对原始光谱进行预处理后，得到的模型预测能力较强、稳健性好。因此，本研究后续将采用1stDer 预处理后的光谱开展模型的构建。

表2 不同方法预处理近红外光谱的结果Table 2 Results of near-infrared spectroscopy by different pretreatment methods

2.3 近红外光谱与提取过程的建模研究

2.3.1 茶皂素质量浓度的Si-PLS 模型 表3 为提取过程中茶皂素的Si-PLS 模型结果。从表中可看出，将光谱划分为16 个区间，并联合其中的4个子区间[2，3，7，14] 时可得到最优的Si-PLS 模型，所对应的光谱区间分别为999.07～1 096.61，1 103.10～1 200.36，1 516.35～1 612.58，2 229.86～2 324.62 nm。999.07～1 096.61 nm 区间包含1 065 nm 和1 029 nm 处的组合频吸收谱带[25]，主要吸收C-H 和O-H 的三级倍频和二级倍频[26]。

在最佳联合子区间下，对提取过程中的茶皂素质量浓度建立定量分析模型，其校正集及预测集样本实测值与预测值之间的散点图如图3a 和图3b 所示。由图可知，对提取过程中茶皂素质量浓度，校正模型的决定系数RC值为0.9858，RM SECV 为1.48，预测模型的决定系数RP值为0.9889，RMSEP 为1.36。

2.3.2 蛋白质质量浓度的Si-PLS 模型 从表3可看出，将光谱划分为16 个区间，并联合其中的4 个子区间[2，3，7，14]时可得到蛋白质质量浓度的最优的Si-PLS 模型，所对应的光谱区间分别为999.07～1 096.61，1 103.10～1 200.36，1 516.35～1 612.58，2 229.86～2 324.62 nm。其中，包含的1 530～1 600 nm 为NH 一级倍频吸收谱带，对蛋白质分析非常重要[27]。

表3 提取过程中茶皂素、蛋白质和多糖质量浓度的Si-PLS 模型优选结果Table 3 Optimization results of Si-PLS model for tea saponin，protein and polysaccharide mass concentration in the extraction process

（续表3）

在最佳联合子区间下，对提取过程中的蛋白质浓度建立定量分析模型，其校正集及预测集样本实测值与预测值之间的散点图如图3c 和图3d所示。由图可知，对提取过程中蛋白质质量浓度，校正模型的决定系数RC值为0.9766，RMSECV 为0.472，预测模型的决定系数RP值为0.9859，RMSEP 为0.354。

图3 Si-PLS 模型中茶皂素、蛋白质和多糖质量浓度实测值与预测值之间的散点图Fig.3 Calibration set and prediction set of Si-PLS joint optimal interval model

2.3.3 多糖质量浓度的Si-PLS 模型 由表3 可得，将光谱划分为18 个区间，并联合其中的4 个子区间[6，7，8，13]时可得到多糖质量浓度的最优的Si-PLS 模型，所对应的光谱区间分别为1 349.00～1 432.76，1 439.20～1 522.77，1 529.19～1 612.58，1 976.30～2 058.85。其中，1 440 nm 附近通常为游离OH 伸缩振动吸收峰[25]。

在最佳联合子区间下，对提取过程中的多糖质量浓度建立定量分析模型，其校正集及预测集样本实测值与预测值之间的散点图如图3e 和图3f 所示。由图可知，对于提取过程中多糖质量浓度，校正模型的决定系数RC值为0.9841，RM SECV 为0.471，预测模型的决定系数RP值为0.9919，RMSEP 为0.359。

2.4 3 种模型的结果比较

为了确定适合提取过程的定量模型，提高模型的建模效果和预测性能，将PLS、iPLS 和Si-PLS建立的模型进行了比较，结果如表4 所示。从表可看出，Si-PLS 模型优于其它2 种模型，对于这3 个关键物质中的任一个，Si-PLS 模型都能得到较好的预测结果，且结果表明利用所开发的原位光谱学系统测量提取过程中的物质是可行的。

用经典PLS 算法对900～2 500 nm 的全光谱信息（包含256 个变量）的回归模型进行校正时，提取工艺中存在的许多共线变量或无关变量（如温度波动）等冗余信息都会削弱PLS 模型的稳健性。从表4 中还可看出，对于提取中茶皂素、蛋白质和多糖质量浓度的模型建立，iPLS 模型甚至比PLS 模型更差。原因可能是iPLS 建模时只有一个子区间，许多数据并没有得到充分应用，从而使校正模型和预测模型都不理想[28]。相较于PLS 和i-PLS，Si-PLS 建模效果最优。因为Si-PLS 模型是在同一次的区间划分下，联合了精度较高的几个光谱子区间建立的PLS 模型[29]。与PLS 和iPLS 相比，Si-PLS 能更好的捕获利用信息，较好的监测提取过程中的茶皂素浓度、蛋白质浓度和多糖浓度。

表4 茶皂素、蛋白质和多糖质量浓度最佳模型筛选结果Table 4 Screening results of optimal model for tea saponin，protein and polysaccharide mass concentration

3 结论

本研究表明，近红外光谱技术在测定茶皂素提取过程中的3 个重要的质量参数——茶皂素质量浓度、蛋白质质量浓度和多糖质量浓度方面具有很大潜力。在对样品无损的前提下，能快速准确的测定提取过程中的物质变化，以判断提取终点。在建立预测模型时，Si-PLS 与传统的PLS 和iPLS校正方法相比，能剔除大量冗余信息，筛选出精度较高的光谱区间，具有很大的优越性。采用近红外光谱技术联合化学计量学方法对茶皂素提取过程进行实时、原位检测，可显著提高提取的质量控制效率和质量保证。