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尖唇散白蚁胚胎发育激光共聚焦扫描显微镜观察

2022-12-28孙仪林王靖怡

昆虫学报 2022年11期
关键词:白蚁箭头显微镜

孙仪林, 王靖怡, 陆 迪, 张 琪

(沈阳农业大学植物保护学院, 沈阳 110866)

白蚁属蜚蠊目(Blattaria)白蚁科(Termitidae),属于半变态昆虫(Djernaesetal., 2015)。系统发育分析证明白蚁是蟑螂的姊妹群因而将其从独立的等翅目划为蜚蠊目的等翅亚目中(Loetal., 2000; Djernaesetal., 2012, 2015; Legendreetal., 2015)。目前,已知白蚁分为9科292属2 878种(Engel, 2011; 程冬保, 2012),我国有白蚁41属473种(程冬保等, 2014)。白蚁是世界范围内的破坏性害虫,每年对房屋建筑、农、林、水利、交通等方面造成严重的危害和经济损失(庞正平, 2018)。全球每年要花费上百亿美元对白蚁进行预防、控制管理以及维护等工作(曹海燕, 2018)。近几年来,白蚁在我国分布较广,已从南方向北方迁移,白蚁危害区域分布的北界已更新至吉林省公主岭市,在辽宁南部地区如大连、丹东亦有为害(马星霞等, 2015)。

根据早期胚带发育类型的不同,昆虫胚带分为短胚带型、中胚带型和长胚带型(Patel, 1994)。全变态昆虫胚胎经历长胚带类型的胚胎发生(Surkovaetal., 2018)。果蝇Drosophila的胚胎沿前后轴方向可分为头节、三胸节和八腹节,两末端又分化出原头与尾节, 其中胚胎沿背部背腹轴分化为羊浆膜、背部外胚层、腹部外胚层与中胚层(Cinnamonetal., 2004)。全变态昆虫胚胎发育经历卵裂胚盘形成,胚带与胚膜形成、胚层分化3个阶段(钦俊德, 1965)。全变态昆虫卵的表面有两层周质,卵裂时子核以射线型“彗星”状质体向卵表面迁移,胚盘由此形成;卵黄内有1~2个消黄细胞,形成卵黄球;卵腹面的胚盘细胞增厚为胚带;浆膜由余下的胚盘细胞发育而成,浆膜形成之后,羊膜即开始发生;随原肠沟出现,胚带分化为里、外两层,外层将来形成外胚层,里层形成中胚层和内胚层(崔峰等, 2004)。

半变态昆虫胚胎经历短胚带类型的胚胎发生(钦俊德, 1965)。半变态的蛩蠊目、蜚蠊目胚带均属于短胚带型(Uchifune and Machida, 2005; Fujita and Machida, 2017),缺翅目昆虫胚带也归类为短胚带型(Mashimoetal., 2014)。白蚁卵的发育依赖于工蚁的梳理清洁行为,离开巢穴且缺失工蚁照顾的白蚁胚胎无法进行正常孵化,因此白蚁胚胎的产生与收集过程中需要大量的工蚁进行辅助。经光学显微镜对白蚁胚胎外部观察,其胚带类型为半变态类昆虫典型的短胚带型(Hu and Xu, 2005)。然而,虽然该研究通过光学显微镜观察其外部影像从而预测出不同的发育阶段,但散白蚁胚胎具体的发育时间及其对应过程未有明确结论。

卵孔(受精孔)处于卵壳的表面,是精子进入卵的通道(孙元星等, 2019)。昆虫卵的卵孔数目一般在1~20个之间(Kawaguchietal., 2002)。栖北散白蚁Reticulitermessperatus卵孔的有无被证实与生殖方式有关,蚁后通过产出无卵孔的卵进行孤雌生殖,通过产出有卵孔的卵进行两性生殖(Yashiro and Matsuura, 2014)。随着蚁后年龄增长,它们开始逐渐产出孤雌生殖的卵作为对两性生殖的补充(Yashiro and Matsuura, 2014)。另一项研究表明,具有孤雌生殖能力的尖唇散白蚁Reticulitermesaculabialis的两性卵和孤雌卵卵孔数没有显著性差异,相反,不具备孤雌生殖能力的黑胸散白蚁R.chinensis的卵的卵孔数有显著性差异(谈彦玲, 2016)。白蚁卵为圆柱形,其卵孔位于钝端,卵孔呈开放漏斗形(谈彦玲等, 2016)。白蚁卵的末端为盾端,前端为尖端,其中卵孔位于卵的末端表面以半圆形排列(Knower, 1900)。昆虫卵早期在受精时就发生卵子与精子的原核结合,所形成的接合子细胞核经过卵裂而形成很多的细胞核(Kawamura, 2001)。受精卵分裂所形成的很多细胞最初分布在卵黄球之间,并向卵周缘移动,在周缘排列成一单层的细胞,形成囊胚层;少数停留在卵黄球间的细胞核成为消黄细胞,随后,在卵腹面的一部分囊胚层细胞发育呈柱状,形成胚盘(或称胚带)。胚盘部分延长之后,分化成为胚胎;其余的囊胚层细胞组成胚外部分(Mlodzik and Gehring, 1987)。卵孔所在位置为我们指示了卵的前端和末端位置,为描述尖唇散白蚁胚胎发育过程提供了方向指示。白蚁是古老的社会性昆虫,也是重要的经济昆虫,了解白蚁胚胎发育对解释白蚁系统发育和进化及有效防治具有重要意义。本研究通过每日收集尖唇散白蚁卵,对其发育状态进行固定,采用DAPI染剂对尖唇散白蚁胚胎进行染色,通过激光共聚焦扫描显微镜(laser confocal scanning microscope, LCSM)成像记录了尖唇散白蚁胚胎在不同阶段的形态发展变化。

1 材料与方法

1.1 白蚁来源和饲养

本研究的供试白蚁种群为尖唇散白蚁R.aculabialis。该种群采集于江西省赣州市南康区(25.658497°N, 114.779166°E)。我们将采集到的白蚁在实验室内以松木屑为食物,饲养于长×宽=40 cm×60 cm的塑料密闭盒中,每隔7 d补充水分并更换新鲜木屑。

1.2 白蚁卵的收集和离巢饲养

我们将100头工蚁和1头兵蚁置于配有湿润原浆纸和松木条的培养皿中,用封口膜封好,置于温度25℃、相对湿度70%~80%的养虫室避光饲养以诱导无翅繁殖蚁。待诱导完成后大约30 d收集无翅繁殖蚁产出的卵。我们将卵置于含有200 μL双蒸馏水的离心管中低速震荡清除表面的杂质和病原菌后,转移到含有0.2 mg/mL四环素和0.2 mg/mL多菌灵的1.5%琼脂糖培养基上,用封口膜封口,放入恒温箱避光放置,在不同发育天数取出用于拍摄发育情况。本次实验共使用了216枚尖唇散白蚁卵。

1.3 胚胎扫描电镜观察

用10%多聚甲醛(paraformaldehyde)固定尖唇散白蚁胚胎,再将其按照30%, 50%, 70%, 90%和100%乙醇分级进行脱水。 之后使用临界点干燥器将卵进行干燥,喷金,使用日立S-4800场发射扫描电子显微镜在15 kV时进行观察(Mashimoetal., 2014)。

1.4 胚胎染色和激光共聚焦扫描显微镜观察

将收集好的不同发育天数的尖唇散白蚁卵置于-80℃冰箱冷冻处理10 min,用30%次氯酸钠(NaClO)对卵壳进行软化,再用1×PBS缓冲液(pH 7.4)润洗3次后,使用10%多聚甲醛(paraformaldehyde)室温下固定1 h,加入预先配好的染色液(DAPI∶PBS=1∶1 000, v/v),室温下避光染色16 h,后用1×PBS清洗3次(Tyleretal., 2013)。将染色的卵置于载玻片上以50%甘油密封,利用激光共聚焦扫描显微镜观察胚胎发育情况。

2 结果

2.1 尖唇散白蚁卵的卵孔

本研究通过扫描电镜对尖唇散白蚁的卵孔进行了观察(图1: A),卵孔敞开呈漏斗形且四周带有细密褶皱;通过显微拍摄对卵孔位置的观察,定位了卵的前后端方向(图1: B)。

图1 尖唇散白蚁卵孔扫描电镜照片Fig. 1 Scanning electron microscope photos of Reticulitermes aculabialis egg micropylesA: 卵孔Egg micropyle; B: 卵外部形态及卵孔External morphology of egg and egg micropyle. 箭头指示卵孔。Egg micropyles are indicated by arrows.

2.2 尖唇散白蚁胚胎发育阶段

根据激光共聚焦扫描显微镜成像下DAPI染色获得的尖唇散白蚁胚胎形态特征,本研究将尖唇散白蚁胚胎发育划分为12个阶段。

第1阶段:第1和2天——卵裂期。经过1~2次分裂后,在第1天有十余个细胞核进一步分裂并扩散到卵表面。从0-24 h到第2天的胚胎经历有丝分裂,细胞核自由地分布于卵黄中(图2: A)。在第2天,大多数细胞核随迁移同步分裂,完成解离阶段(图2: B)。第2天开始,随着分裂的进行,均匀分布的细胞进一步分化并迁移到周围形成胚层。

图2 尖唇散白蚁胚胎发育第1阶段DAPI染色后激光共聚焦显微镜照片Fig. 2 Photos of the 1st stage of the embryonic development of Reticulitermes aculabialis taken under laser confocal microscope after DAPI stainingA: 第1天卵1-day-old egg; B: 第2天卵2-day-old egg. 白色箭头指示卵核。Egg nucleus is indicated by white arrows.

第2阶段:第3天——准备期。数十个细胞核从整个卵分离到后边缘的凸面,形成一个由细胞浓缩而成的合胞胚层。浓缩的合胞胚层形成于后周的背侧,即胚胎区,卵黄中只剩下少量卵黄细胞(图3)。

图3 尖唇散白蚁胚胎发育第2阶段第3天卵DAPI染色后激光共聚焦显微镜照片Fig. 3 Photos of the 3-day-old egg of the 2nd stage of the embryonic development of Reticulitermesaculabialis taken under laser confocal microscope after DAPI staining白色箭头指示卵核。Egg nucleus is indicated by white arrows.

第3阶段:第4和5天——胚层形成。胚层由非常薄的一层密集细胞构成,多个胚胎原基排列成球状结构作为胚胎盘,一个高密度的胚泡被浓缩,并在后端融合成一个近圆盘状结构(图4: A)。胚盘细胞变扁收缩向卵内迁移;浓缩的胚盘细胞在卵的后部增殖并形成胚层,使浆膜细胞和次级卵黄细胞向各个方向分离;密集的胚盘从卵末端向中间移动;由细胞组成的胚层大小均匀地分布在卵内(图4: B)。

图4 尖唇散白蚁胚胎发育第3阶段DAPI染色后激光共聚焦显微镜照片Fig. 4 Photos of the 3rd stage of the embryonic development of Reticulitermes aculabialis taken under laser confocal microscope after DAPI stainingA: 第4天卵4-day-old egg; B: 第5天卵5-day-old egg. 白色箭头指示胚层。Germ layer is indicated by white arrows.

第4阶段:第6天——早期胚带形成。细胞聚集到后端形成早期胚带(图5: A)。新形成的胚盘在卵的后端沿末端内表面拉长;原始胚带的前端朝向卵的后轴代表头叶,后延伸至卵的前极作为腹部;早期胚带被覆盖,并沿卵末端向前端进一步伸长(图5: B)。

图5 尖唇散白蚁胚胎发育第4阶段第6天卵DAPI染色后激光共聚焦显微镜照片Fig. 5 Photos of the 6-day-old egg of the 4th stage of the embryonic development of Reticulitermesaculabialis taken under laser confocal microscope after DAPI stainingA: 细胞聚集到卵后端形成早期胚带Cells gathered at the back end of the egg to form early germ band; B: 早期胚带被覆盖,并沿卵末端向前端进一步伸长The early germ band was covered and further elongated along the front end of the egg. 白色箭头指示早期胚带。Early germ band is indicated by white arrows.

第5阶段:第7天——开始分裂。胚胎出现短生殖带,后端沿着浆膜向卵的前极移动;在分裂过程中发生胚胎内陷,纵向原肠沟出现;胚带随拉长和加厚逐渐清晰,可分化为胚胎的头区和原球茎区(图6)。

图6 尖唇散白蚁胚胎发育第5阶段第7天卵DAPI染色后激光共聚焦显微镜照片Fig. 6 Photo of the 7-day-old egg of the 5th stage of the embryonic development of Reticulitermesaculabialis taken under laser confocal microscope after DAPI staining白色箭头指示胚芽。Germ anlage is indicated by white arrows.

第6阶段:第8和9天——胚带的伸长与分节。胚带沿着内表面在卵黄中继续向上伸长。当1/3的胚带向上伸长时,在卵的背侧成U形(图7: A);胚带从卵的外层与原始生殖层中分化出来(图7: B);胚胎开始拉长,主头叶显著伸展;胚胎末端向卵前极伸长,腹部开始分节(图7: C)。

图7 尖唇散白蚁胚胎发育第6阶段DAPI染色后激光共聚焦显微镜照片Fig. 7 Photos of the 6th stage of the embryonic development of Reticulitermes aculabialis taken under laser confocal microscope after DAPI stainingA: 第8天卵8-day-old egg; B: 第9天卵9-day-old egg; C: 第9天卵胚带Germ band of the 9-day-old egg. 白色箭头指示胚带,桔色箭头指示主头叶,红色箭头指示胚带末端。Germ band is indicated by white arrows, head lobe by orange arrow, and caudal end of germ band by red arrows.

第7阶段:第10-12天——腹部分节,出现双曲结构。胚带逐渐变宽和增厚且长度超过卵的全长,胸部腹部开始分节 (图8: A);胚带弯曲,出现上颌骨、下唇、前、中、后胸、上颌、前、中、后足结构(图8: B);胚带出现明显弯曲结构,前后轴未逆转。(图8: C)。

图8 尖唇散白蚁胚胎发育第7阶段DAPI染色后激光共聚焦显微镜照片Fig. 8 Photos of the 7th stage of the embryonic development of Reticulitermes aculabialis taken under laser confocal microscope after DAPI stainingA: 第10天卵10-day-old egg; B: 第11天卵11-day-old egg; C: 第12天卵12- day-old egg. 黄色箭头指示胸部分节,蓝色箭头指示腹部分节,白色箭头指示胚带,红色箭头指示弯曲结构。Thoracic segment is indicated by yellow arrows, abdominal segmentation by blue arrows, germ band by white arrows, and caudal flexure by red arrows.

第8阶段:第13-15天——分节和生长和两次旋转。胚胎完全浸没在卵中并进一步生长,在腹部末端形成刷状结构。头部进一步扩大并向后弯曲,背侧闭合 (图9: A)。胚带伸长,分节范围进一步扩大;头囊迅速分化,触角和口器开始形成;头叶向后弯曲至末端并开始内卷,随着头叶变宽,触角逐渐明显;尾部在卵后端向内弯曲变宽;此阶段胚胎完成伸展,胸腹开始分节;胚胎缩短变粗,触角被拉长并开始分节;头部从后极转向前极 (图9: B)。头部和腹部同时伸展,头部的方向由后极向前极发生了反向变化(图9: C, D)。

图9 尖唇散白蚁胚胎发育第8阶段DAPI染色后激光共聚焦显微镜照片Fig. 9 Photos of the 8th stage of the embryonic development of Reticulitermes aculabialis taken under laser confocal microscope after DAPI stainingA: 第13天卵13-day-old egg; B: 第14天卵14-day-old egg; C, D: 第15天卵15-day-old egg. 白色箭头指示头部,紫色箭头指示触角,桔色箭头指示腹部。Head is indicated by white arrows, antenna by purple arrows, and abdomen by orange arrows.

第9阶段:第16和17天——快速发育。胚胎沿着卵背侧并向卵前端进一步伸长。末端呈弯钩状(图10: A)。背侧发生闭合并随着胚胎下降而向后弯曲;胚胎高度收缩,头部呈朝上且向后状态,头和胸部在第16天到达卵末端;随着头和腹部位置的改变,胚胎从第16天到第17天进一步扩大生长,头部和胸部向后弯曲并延伸到背侧,上颌与附肢在后极处面向卵内;腹部向卵的中间区域略微下沉,随着胚胎进一步变宽伸长,腹部明显地向腹面卷曲(图10: B)。胚胎几乎占据卵体积的一半。

图10 尖唇散白蚁胚胎发育第9阶段DAPI染色后激光共聚焦显微镜照片Fig. 10 Photos of the 9th stage of the embryonic development of Reticulitermes aculabialis taken under of laser confocal microscope after DAPI stainingA: 第16天卵16-day-old egg; B: 第17天卵17-day-old egg. 白色箭头指示头部,绿色箭头指示触角,桔色箭头指示腹部,紫色箭头指示附肢,蓝色箭头指示上颚。Head is indicated by white arrows, antenna by green arrows, abdomen by orange arrows, appendage by purple arrows, and maxilla by blue arrows.

第10阶段:第18-20天——附肢发育明显。胚胎占据卵中大部分空间;背侧闭合完全,头叶进一步扩大,变成球状并向后弯曲(图11: A)。与前一阶段相比胸部明显伸长 (图11: B)。头部向后弯曲近乎45°;以下颌区面向卵后端;腹部分节清晰可见,胚胎呈直线状,位置靠近卵的内侧(图11: C)。

图11 尖唇散白蚁胚胎发育第10阶段DAPI染色后激光共聚焦显微镜照片Fig. 11 Photos of the 10th stage of the embryonic development of Reticulitermes aculabialis taken under laser confocal microscope after DAPI stainingA: 第18天卵18-day-old egg; B: 第19天卵19-day-old egg; C: 第20天卵20-day-old egg. 白色箭头指示头部,绿色箭头指示触角,桔色箭头指示腹部,紫色箭头指示附肢,蓝色箭头指示下颚。Head is indicated by white arrows, antenna by green arrows, abdomen by orange arrows, appendage by purple arrows, and mandible by blue arrows.

第11阶段: 第21-24 天——内部器官迅速发育。 随着胚胎生长的进一步发展,胚胎占据卵的全部空间,其中头部和腹部分别延伸到卵的末端和前端(图12: A)。内部器官发育良好,头囊完整,头叶增大,唇延伸覆盖下颌;最终形成头部向卵的腹侧弯曲形态;触角鞭毛继续拉长并进一步细分(图12: B, C, D)。

图12 尖唇散白蚁胚胎发育第11阶段DAPI染色后激光共聚焦显微镜照片Fig. 12 Photos of the 11th stage of the embryonic development of Reticulitermes aculabialis taken under laser confocal microscope after DAPI stainingA: 第21天卵21-day-old egg; B: 第22天卵22-day-old egg; C: 第23天卵23-day-old egg; D: 第24天卵24-day-old egg. 白色箭头指示头部,绿色箭头指示触角,桔色箭头指示腹部,紫色箭头指示足,蓝色箭头指示下颚。Head is indicated by white arrows, antenna by green arrows, abdomen by orange arrows, leg by purple arrows, and mandible by blue arrows.

第12阶段:第25-30天——完成发育并孵化。胚胎进一步发育使头部完全融合在背部区域,下颌拉长并加宽,触角进一步拉长(图13: A, B)。下颚清晰可见,幼虫表皮发育完全,腹部有刚毛(图13: B, F)。胚胎在卵包膜内移动;胚胎的折叠方向为腹弯或背伸(图13: C, D, E)。胚胎头部挤压卵壳,并于被中缝处将其挤破,胚胎发育过程全部完成。胚胎在工蚁的帮助下,整个身体从卵壳中孵化而出(图13: F)。同时,尖唇散白蚁胚胎发育后期的触角、刚毛、触角分节,腹部刚毛、腹部分节、前中后足、上颚、下颚以局部放大形式展现,可以准确识别其发育历期及各部分的发育特征(图14)。

图13 尖唇散白蚁胚胎发育第12阶段DAPI染色后激光共聚焦显微镜照片Fig. 13 Photos of the 12th stage of the embryonic development of Reticulitermes aculabialis taken under laser confocal microscope after DAPI stainingA: 第25天卵25-day-old egg; B: 第26天卵26-day-old egg; C: 第27天卵27-day-old egg; D: 第28天卵28-day-old egg; E: 第29天卵29-day-old egg; F: 第30天卵30-day-old egg. 白色箭头指示头部,绿色箭头指示触角,桔色箭头指示腹部,紫色箭头指示足,蓝色箭头指示下颚。Head is indicated by white arrows, antenna by green arrows, abdomen by orange arrows, leg by purple arrows, and mandible by blue arrows.

图14 尖唇散白蚁胚胎发育末期胚胎DAPI染色后激光共聚焦显微镜局部放大照片Fig. 14 Enlarged photos of partial embryo in the late stage of the embryonic development of Reticulitermes aculabialistaken under laser confocal microscope after DAPI stainingA: 第22天卵22-day-old egg; B: 第27天卵27-day-old egg; C: 第30天卵30-day-old egg. 白色箭头指示触角,桔色箭头指示腹部刚毛,绿色箭头指示腹部分节,蓝色箭头指示前中后足,红色箭头指示上颚,紫色箭头指示下颚。Antenna is indicated by white arrows, abdominal seta by orange arrows, abdominal segmentation by green arrows, fore, mid and hind legs by blue arrows, maxilla by red arrows, and mandible by purple arrows.

我们通过整合各个阶段的发育特征图片将尖唇散白蚁胚胎动态发育全过程整体地展示了出来(图15)。通过此项研究,我们完整地描述了尖唇散白蚁胚胎从细胞分化到发育完成全过程并对各个发育阶段进行了清晰的图片采集和形态展示(图15)。

图15 尖唇散白蚁胚胎发育全过程DAPI染色后激光共聚焦显微镜照片Fig. 15 Photos of the whole process of the embryonic development of Reticulitermes aculabialis taken under laser confocal microscope after DAPI staining

图16 尖唇散白蚁胚胎发育12个阶段全过程示意图Fig. 16 Schematic diagrams of the 12 stages of the embryonic development of Reticulitermes aculabialisA: 第1阶段The 1st stage; B: 第2阶段The 2nd stage; C: 第3阶段The 3rd stage; D: 第4阶段The 4th stage; E: 第5阶段The 5th stage; F: 第6阶段The 6th stage; G: 第7阶段The 7th stage; H: 第8阶段The 8th stage; I: 第9阶段The 9th stage; J: 第10阶段The 10th stage; K: 第11阶段The 11th staget; L: 第12阶段The 12th stage.

3 讨论与结论

3.1 蜚蠊目及其近缘昆虫胚胎的发育阶段及其特征

在模式昆虫果蝇中,研究者按照不同发育阶段将胚胎发育全程形态学变化分为10~14个阶段(Gaoetal., 1996)。 西伯利亚蝗Gomphocerussibiricus的胚胎发育被分为12个阶段(闫蒙云等, 2018)。作为与白蚁亲缘关系较近的蜚蠊目蟑螂的胚胎发育阶段分为12个(Djernaesetal., 2015; Fujita and Machida, 2017)。古老而稀有的缺翅目昆虫胚胎发育也按照形态学变化分为了12个阶段(Mashimoetal., 2014)。以上研究为本项目在尖唇散白蚁胚胎发育阶段的划分提供了依据与借鉴。

针对白蚁的胚胎发育研究首次由Knower对里佩特象白蚁Nasutitermesrippertii开展,该研究主要针对白蚁卵的卵孔形态,位置及胚胎的胚带进行了描述。同时,该研究者还将后麻头堆砂白蚁Cryptotermesbrevis的发育和胚胎变化进行了解剖图解(Knower, 1900)。之后,人们运用光学显微镜对北美散白蚁Reticulitermesflavipes的胚胎动态变化进行外部形态观察,将胚胎发育分成了卵裂和囊胚的形成、胚盘和胚带的形成、伸长和分节、形成尾弯、旋转和闭合、孵化6个阶段(Hu and Xu, 2005)。尽管该研究对白蚁胚胎进行了外部形态的观察,但并未对白蚁胚胎的发育进行细胞水平的观察及对其发育的动态过程进行详细解释。我们的研究对白蚁胚胎发育进行了更为深入的观察和描述,在囊胚层形成前我们发现数十个细胞从卵分离到后边缘的凸面,形成合胞胚层(图3: A)。

3.2 昆虫胚盘及胚带发育类型

昆虫的胚胎发生经历精子和卵子的原核结合和有丝分裂 (Kawamura, 2001)。在一些昆虫(如果蝇)中,这种早期胚盘是合胞体,由围绕卵黄的一层细胞核组成,最终,这个胚盘将细胞化,形成一个细胞胚盘,其本质上是一层细胞;在其他昆虫(如蝗虫)中,合胞体胚盘没有延长,细胞核在到达卵的表面后立即或很快细胞化(Sander, 1983)。此时,胚盘的一部分被指定为胚胎原基,而其余部分形成了胚外组织。在本研究的尖唇散白蚁中,受精卵核分裂后聚集形成合胞体胚盘,合胞体胚盘未发生延长,细胞分裂与细胞胚层分化完成后形成浆膜,胚胎延伸至卵的腹面后进行生长与分化(图4)。

关于胚胎分节的模式化时间和方式,研究者将昆虫胚带分为3种胚胎发生模式:短胚带型、中胚带型和长胚带型胚胎发生(Patel, 1994)。短胚芽、中胚芽和长胚芽现在被用来描述胚芽原基的初始大小和胚胎发生的差异(Sander, 1983)。那些尚未从胚芽原基的短后部区域(片段形成区或生长区)中指定的片段亦在发育过程中经历了大量生长。因此,尽管在腹前原基的生长期内的整个胚胎分节都是由低比例的亚分节完成的,但短胚带型昆虫的分节需要一个次级生长阶段,再加上更多后续的指定过程才可完成发育(Shimizu, 2013)。

蜚蠊胚胎经历短胚带类型的胚胎发生,并在卵的腹侧伸长至其全长。一种没有分裂迹象的小型心形胚胎形成,随着从前到后连续分裂,胚带随生长而拉长,这是一种典型的短胚带胚胎发生类型(Fujita and Machida, 2017),在其他蜚蠊中也有发现:例如美洲大蠊Periplanetaamericana(Lenoir-Rousseaux and Lender, 1970)和德国小蠊Blattellagermanica(Wheeler, 1889)。这种发育类型在无翅目昆虫和古翅目昆虫中占主导地位(Djernaesetal., 2012, 2015),是该谱系的一个基本特征。而白蚁的胚胎发育模式与直翅目相似(Knower, 1900)。首先,白蚁和直翅目昆虫均属于短胚带型,胚胎从一个圆盘状的雏形开始延伸,发育过程仅发生在其尾部的前后序列。而蜚蠊胚胎则沿着其胚胎雏形发育而来,在两端进行延伸(Fujita and Machida, 2017)。第二,白蚁和直翅目及蜻蜓目,在胚带伸长过程中均形成尾部弯曲,但蜚蠊在发育过程中则没有这个阶段(Knower, 1900)。第三,白蚁和某些蝗虫的胚胎发育通过围绕一个或两个卵轴旋转来改变其胚胎位置(囊胚形成),而蜚蠊胚胎则保持相同的位置不变,直到整个发育阶段结束 (Kawanishi, 1975)。

3.3 蜚蠊目昆虫胚胎发育过程中的两极反转

蜚蠊的胚胎在发育过程中前后轴从未发生逆转,为非逆转型(Fujita and Machida, 2017)。蜚蠊的胚胎由成对的胚盘区域融合而成,在卵的腹侧有较高的细胞密度,其胚胎发育具有如下4个重要特征:(1)胚胎是由具有较高细胞密度的配对胚层区域融合形成的;(2)胚胎经历短胚带类型的胚胎发生,节段向后依次分化;(3)胚胎在卵表面拉长到完整长度;(4)发生背侧闭合,最后胚胎获得其确定形式,在卵的前后轴保持其原始位置而非腹侧(Fujita and Machida, 2017)。“聚集在卵腹侧的卵孔”是蜚蠊胚胎发育的共同特征(Fujita and Machida, 2014)。白蚁的卵孔位于卵的“背侧”(Mukerji, 1970)。白蚁的胚胎雏形位于卵后凸区的胚带,胚盘延长伴随着前后序列的连续节段形成,胚带的末端沿着后极周围的边缘向卵的前极前进。胚胎的持续延长导致卵在前极出现特征性的双尾弯曲,完成体节分节后发生旋转(囊胚运动),并在此过程中观察到两个连续的旋转(Hu and Xu, 2005)。我们观察到在白蚁胚胎发育的第8阶段胚胎头部首先扩大,伸长,向后弯曲至极末端并开始内卷,后随着胚胎的缩短变粗,头部沿卵的内壁,由后极向前极改变位置(图9)。

一般来说,来自不同科的白蚁具有相似的胚胎发育模式(Mukerji, 1970)。半变态昆虫有较短的胚带类型,占据更多的运动空间使其在胚胎发育过程中显示出明显的囊胚形成运动(Kristensen, 2009)。进化等级较低的白蚁(如木白蚁科和草白蚁科)的卵相对较大,它们的胚胎围绕两个轴经历了一个连续进化的运动(Geigy and Striebel, 1959)。此外,在整个发育过程中,它们的胚胎仍保持在卵表面的位置。相比之下,进化等级较高的白蚁(白蚁科)的卵相对较小,只绕短轴旋转一次,胚胎的腹部区域在旋转之前进入卵黄细胞中(Jaeger, 2011)。

3.4 结论

本研究依据Matsuura和Kobayashi(2007)将白蚁胚胎分离消毒并置于含0.2 mg/mL四环素的琼脂糖平板上对白蚁卵壳抑菌处理,成功完成了人工离巢饲养,通过减少实验中工蚁的用量而创新地优化了实验方法。根据本实验的结果,尖唇散白蚁胚胎发育的过程中,除最后的孵化过程需要工蚁将卵咬破,才可使已经成型的胚胎正常孵化之外,其余人工离巢饲养的尖唇散白蚁胚胎与正常巢穴发育的尖唇散白蚁胚胎发育历期一致。

此外,本研究研制出了一套可以对白蚁胚胎的不同发育阶段进行全胚胎染色的方法,通过激光共聚焦显微镜观察并记录了白蚁胚胎发育的全过程,明确揭示了白蚁胚胎发育各个阶段的主要特征。我们将全过程分为12个阶段(图16)——卵裂期、准备期、胚层形成、早期胚带形成、开始分裂、胚带伸长与分节、腹部分节并出现双曲结构、发生两次旋转、快速发育、附肢发育明显、内部器官迅速发育和发育完成,并对全部过程进行了描述。

综上所述,本研究通过观察对尖唇散白蚁R.aculabialis卵的产生收集与胚胎发育,探索出更加系统的尖唇散白蚁胚胎体外人工培养、卵壳软化与观察方法,系统地了解了胚胎发育的毎日変化,并将其与其亲缘关系相近的物种进行了发育过程中各个阶段的比较,为揭示白蚁的胚胎发育提供理论依据。

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