吕亚茹 王菲 张婷婷 陈红 严俊鑫

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

玫瑰(Rosarugosa)花大色艳，香气浓郁，多次开花且花期长，是优良的园林绿化材料，同时具有极高经济价值，广泛应用于食品、制药、精油行业[1]。舞毒蛾(Lymantriadispar)是一种世界性害虫，食性杂、分布广、危害较大[2]，是玫瑰的主要害虫之一，严重影响玫瑰的生长，降低玫瑰的价值，对玫瑰产业造成巨大损失。目前虫害防治主要依靠化学药剂，此方法不仅污染环境，药品残留对玫瑰的食品安全性造成威胁。因此，探究环境友好的绿色生物防治技术成为当下的迫切需求。

丛枝菌根(AM)真菌，作为一种生态友好的微生物广泛存在于土壤中，能与陆地大约80%的植物根系形成共生体，提高植物抗性[3]。接种AM真菌提高了紫花苜蓿(Medicagosativa)[4]、箭舌豌豆(Acyrthosiphonpisum)[5]和乌桕(Triadicasebifera)[6]的抗虫性。取食接种AM真菌的花生(Arachishypogaea)和番茄(Lycopersiconesculentum)抑制了甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)的生长发育，使其存活率下降、幼虫发育历期和蛹期明显延长[7]。用接种异形孢囊霉(Rhizophagusirregularis)的番茄(SolanumlycopersicumL.)喂养甜贪夜蛾(Spodopteralittoralis)幼虫，其体质量和存活率比对照分别降低32%和19%[8]。相关研究表明AM真菌作为一个连接植物和昆虫的桥梁，可以通过调控植物生长和生理生化等来增强植物对昆虫的防御[9-10]，因此，这为生物防治提供了新的探索思路。

遭受虫害胁迫时会破坏植物正常生长代谢所保持的动态平衡，诱导活性氧大量生成，因此在植物应对虫害胁迫时会启动相关防御酶进行防御[11]。苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)等防御酶可促进植物体合成抗虫物质，使昆虫中毒，影响其取食、消化及生长发育[11-12]，在植物应对虫害胁迫中起重要作用。对菜青虫(Pierisrapae)表现出显著抗性的野生甘蓝(Brassicaincana)体内的PPO、POD和PAL酶活性显著升高[13]。胰蛋白酶抑制剂(TI)和胰凝乳蛋白酶抑制剂(CI)能与昆虫消化道内的蛋白消化酶相互作用，从而使昆虫厌食，降低昆虫体质量并抑制其生长发育[14]。柳蛎盾蚧(Lepidosaphessalicina)危害盛期，丁香(Syringaspp.)的TI和CI升高幅度与丁香抗虫性呈正相关[15]。植物次生代谢产物是植物抵抗病虫害防御中协同进化的结果[16]，其中在抗虫中起重要作用的次生代谢物有单宁、酚类和类黄酮等物质，影响昆虫的取食和生长发育[17]。致瘿昆虫(gall-inducing insects)常诱导寄主植物合成大量酚类，植物对致瘿昆虫的抗性与体内酚类化合物质量分数呈正相关[18]。小麦(Triticumaestivum)叶片内高的总酚和单宁质量分数抑制了草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)幼虫的取食[19]。在研究杨树(Populusspp.)抗虫性时发现类黄酮化合物是杨树的重要抗虫物质[20]。

目前，关于AM真菌应用于园林植物抗虫胁迫的研究尚不多见，本研究以紫枝玫瑰为植物材料，测定取食菌根玫瑰对舞毒蛾幼虫发育历期及体质量的影响，以及接种AM真菌后玫瑰体内防御蛋白及次生代谢物质的变化，探究接种丛枝菌根真菌对紫枝玫瑰应答舞毒蛾胁迫的影响，丰富AM真菌提高植物抗虫性相关研究，为生物防治相关理论研究提供参考。

1 材料与方法

玫瑰品种为紫枝玫瑰(Rosarugose‘Zi Zhi’)，选取粗细长短一致的健康枝条于2020年1月在温室进行扦插。V(珍珠岩)∶V(蛭石)∶V(花卉土)=1∶1∶1混合，经高压蒸汽121 ℃灭菌2 h。玫瑰扦插于直径为15 cm、高13 cm的花盆中，插后立即浇透水，每隔7 d每盆喷施1/4的无磷Hoagland营养液，用于试验。

AM真菌为摩西斗管囊霉(FM)，购买于甘肃省武威市林科院，为孢子、菌丝及菌根根段的土壤混合物。试验昆虫为舞毒蛾幼虫，卵块采自林场，用10%的甲醛溶液消毒1 h，洗净后放入温度为(25±1)℃、相对湿度为(70±1)%、光周期为16 h黑暗和8 h光照的培养箱孵化，之后用人工饲料喂养至3龄用于试验。

试验于2020年5月下旬进行，2个AM真菌处理，接种AM真菌摩西斗管囊霉(FM)和不接种AM真菌(NM)；2个舞毒蛾处理，接虫(infestation byLymantriadispar，L)与不接虫；共4个处理组：NM、FM、NM+L、FM+L，每个处理组3个重复，共计60盆。每盆混入AM真菌孢子数量为12个/g的真菌混合物30 g(FM处理)，对应的NM处理添加30 g灭菌基质，2个月后测定菌根侵染率。随后做接虫处理，选取新蜕皮不超过12 h，大小一致的3龄舞毒蛾幼虫饥饿处理12 h，一部分幼虫用玫瑰叶片进行喂养，测定幼虫发育历期及体质量，每个处理20头。另一部分接到玫瑰植株上，每个处理3株，每株3头幼虫，外套纱网系紧，接虫5 d后收获植株，存放于冰箱-80 ℃保存用于生理生化指标的测定。

菌根侵染率的测定依据Phillips[21]方法测定，并略有改进，采用台盼蓝染色。将清洗干净的根剪成0.5～1.0 cm的小段放入试管中，加入5% KOH溶液90 ℃水浴20 min后再用清水洗3次，乳酸酸化5 min后再用0.2%酸性品红乳酸甘油染色液90 ℃水浴20 min染色，制成临时切片在荧光显微镜下镜检观察。菌根侵染率=(被侵染的根段数/镜检总根段数)×100%，最后测得的FM菌根侵染率为70.12%。

舞毒蛾幼虫指标测定。采取新鲜玫瑰叶片喂养舞毒蛾幼虫，在幼虫蜕皮进入4、5和6龄时，记录幼虫的发育历期，用电子分析天平称量每头舞毒蛾幼虫体质量。

苯丙氨酸解氨酶(PAL)采用苯丙氨酸比色法，多酚氧化酶(PPO)采用邻苯二酚法，过氧化物酶(POD)采用愈创木酚法，胰蛋白酶抑制剂(TI)和胰凝乳蛋白酶抑制剂(CI)采用孟昭君[22]和段文昌等[23]的方法测定，总酚采用福林酚比色法，黄酮和单宁采用王燕芳[24]的方法。

用Excel2011统计数据，SPSS26.0计算平均值和标准差，独立样本T检验对同一龄期下的发育历期和体质量进行分析，用单因素分析对防御蛋白活性和次生代谢物质质量分数进行一般描述与统计并进行事后多重比较(LSD法)，用一般线性分析对取食和AM接菌两因素进行双因素方差分析，用皮尔逊相关性系数对舞毒蛾幼虫发育历期、体质量及玫瑰各指标进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 接种AM真菌对舞毒蛾生长发育的影响

由表1可知，与NM相比，取食菌根玫瑰叶片显著延长了舞毒蛾幼虫4、5和6龄的发育历期，分别延长了2.48、1.07和1.29d。取食菌根玫瑰叶片显著降低了舞毒蛾幼虫4、5和6龄的体质量，与NM相比，分别降低了34.10%、22.17%和23.89%。

表1 接种AM真菌后舞毒蛾幼虫发育历期和体质量的情况

2.2 玫瑰植株防御酶活性

接种AM真菌与玫瑰叶片中的PAL、PPO和POD活性存在显著相关性(表2)。接种前，相比于NM，接种FM显著提高了玫瑰叶片的PPO和POD酶活性，分别提高了66.35%和34.04%；接种后，接种FM的玫瑰叶片表现出更高的PPO和POD酶活性，分别提高了36.28%和11.92%(表3)。

表2 AM真菌、舞毒蛾及两者互作效应方差分析P值

舞毒蛾幼虫取食与玫瑰叶片中的PAL、PPO和POD活性极显著相关(表2)。无论是否接菌，舞毒蛾幼虫取食均显著提高了玫瑰叶片的PAL、PPO和POD酶活性；对于未接菌处理的NM来说，舞毒蛾幼虫取食显著提高了玫瑰叶片的PAL、PPO和POD酶活性，分别提高了131.39%、215.68%和221.28%；对接种FM来说，舞毒蛾幼虫取食后的玫瑰叶片表现出更高的PAL、PPO和POD酶活性，分别提高了100.29%、158.62%和168.25%(表3)。

AM真菌与玫瑰叶片中的CI和TI活性存在显著相关性(表2)。无论是否做接虫处理，接种FM均较NM表现更高的TI和CI活性。接虫前，接种FM显著提高了玫瑰叶片的TI和CI，分别提高了34.80%和49.19%；接虫后，接种FM的玫瑰叶片较未接菌表现出更高的TI和CI活性，分别提高了62.77%和41.74%(表4)。

表4 接种AM真菌和舞毒蛾取食下玫瑰叶片TI和CI的活性 U·g-1

舞毒蛾幼虫取食与玫瑰叶片中的CI活性极显著相关，但与TI活性无显著相关性(表2)。对于NM和FM来说，舞毒蛾幼虫取食均显著提高了玫瑰叶片的TI和CI。对于NM来说，舞毒蛾幼虫取食显著提高了玫瑰叶片的TI和CI，分别提高了5.92%和73.58%；对于FM，舞毒蛾幼虫取食提高了玫瑰叶片的TI和CI活性分别为27.90%和64.91%(表4)。

2.3 玫瑰植株抗虫次生代谢产物质量分数

AM真菌与玫瑰叶片中的黄酮、总酚和单宁质量分数存在显著相关性，且与总酚和单宁质量分数呈极显著相关(表2)。无论是否接虫，较NM玫瑰来说，接种FM的玫瑰叶片表现更高黄酮、总酚和单宁质量分数；接虫前，对NM玫瑰来说，接种FM显著提高了玫瑰叶片的黄酮、总酚和单宁质量分数，分别提高了35.50%、23.75%和35.49%；接虫后，接种FM显著提高了玫瑰叶片的黄酮、总酚和单宁质量分数，分别提高了44.09%、23.80%和21.19%(表5)。

舞毒蛾幼虫取食与玫瑰叶片中的总酚质量分数显著相关，与单宁质量分数呈极显著相关，但与黄酮质量分数无显著相关性(表2)。无论是否接菌，舞毒蛾幼虫取食均未显著改变玫瑰叶片的黄酮质量分数。对于NM玫瑰来说，舞毒蛾幼虫取食显著提高了玫瑰叶片中的总酚质量分数14.06%，显著提高了玫瑰叶片中的单宁质量分数42.90%；对于FM玫瑰来说，舞毒蛾幼虫取食显著提高了玫瑰叶片中的总酚质量分数14.12%，显著提高了玫瑰叶片中的单宁质量分数27.81(表5)。

2.4 相关性分析

图1为舞毒蛾幼虫发育历期、体质量及玫瑰各指标的相关性分析。体质量与玫瑰POD酶活性呈显著负相关，舞毒蛾幼虫发育历期与玫瑰的PAL酶活、总酚和单宁质量分数极显著相关，与玫瑰CI、TI、PPO、POD酶活和黄酮质量分数呈显著正相关，说明玫瑰各指标与玫瑰抵抗舞毒蛾防御相关，接种AM真菌通过增强玫瑰防御蛋白活性和提高抗虫相关次生代谢物质质量分数增强了玫瑰对舞毒蛾的防御，提高了玫瑰的抗虫性。

*表示显著相关(P<0.05),** 表示极显著相关(P<0.01)。

3 讨论与结论

根据慢生长-高死亡率假说，发育期延长的昆虫更难完成整个发育历期繁衍后代，更容易被天敌捕食，所以抑制昆虫的生长发育说明植物在抵抗防御[25]。用接种摩西斗管囊霉的银中杨(Populusalba×P.berolinensis)叶片喂养舞毒蛾幼虫显著延长了其4和5龄幼虫的发育历期，体质量、体长和头鞘宽显著降低，存活率也显著降低[26]。本研究也表明取食菌根玫瑰叶片显著降低了4、5和6龄舞毒蛾幼虫的体质量，延长了其发育历期，说明取食菌根玫瑰叶片显著抑制了舞毒蛾幼虫的生长发育，提高了玫瑰对舞毒蛾的抗性。

研究表明PPO、PAL和POD可以通过改变植物体内的酚类物质而干扰植物对昆虫的营养利用产生防御[27]。舞毒蛾取食诱导了小黑杨(Populussimonii×P.nigra)叶片中PPO、POD和PAL的活性增高[28-29]。接种根际促生菌(Bacillusvelezensis)番茄幼苗的PPO和POD活性显著增高，提高了番茄对斜纹夜蛾(Spodopteralitura)的抗性[30]。在本研究中，接种AM真菌的玫瑰叶片体内表现了更高的PPO、PAL和POD活性，说明接种AM真菌诱导了玫瑰叶片防御酶活性的提高，增强了玫瑰的防御。植物蛋白酶抑制剂通过削弱或阻断消化酶对食物中的蛋白质起水解消化作用，刺激昆虫消化酶过度分泌，使昆虫产生厌食反应[31]。瘿螨(AceriapallidaKeifer)取食使枸杞(LyciumbarbarumL.)叶片中的CI和TI明显增强，表明枸杞在瘿螨危害下诱导了抗虫性[23]。该研究也表明舞毒蛾取食后的菌根玫瑰叶片体内的CI和TI显著高于未接种玫瑰叶片，说明接种AM真菌诱导玫瑰对舞毒蛾幼虫具有更强的防御。

植物在遭到虫害后会通过积累一些次生代谢物质来抵抗防御，部分次生代谢物质会对昆虫产生趋避、引诱、拒食、毒杀和不育等作用，抑制昆虫的生长发育[32]。单宁和类黄酮化合物因其涩性，降低昆虫的适口性从而使昆虫产生拒食[33]。酚类物质与昆虫肠道中蛋白酶共价结合，抑制昆虫体内的消化酶来抑制昆虫的消化，从而产生防御[34]。接种摩西斗管囊霉显著提高了银中杨叶片中的黄酮、总酚和单宁质量分数[26]。用添加有黄酮或单宁的人工饲料喂养美国白蛾(Hyphantriaaunea)幼虫，其取食量、食物转化率、食物利用率和相对增长率均不同程度的低于对照组[35]。王亚军等[36]也发现黄酮类化合物中的山奈酚对舞毒蛾幼虫有很强的拒食效果。本试验中，接种AM真菌的玫瑰叶片中的总酚、黄酮和单宁质量分数显著高于未接种的玫瑰植株，说明接种AM真菌促进了玫瑰叶片中次生代谢物质的积累，提高了玫瑰的防御。

本试验结果表明，接种AM真菌显著延长了舞毒蛾幼虫的发育历期，降低了舞毒蛾幼虫的体质量，抑制了其生长发育。通过进一步的生理测定，发现接种AM真菌显著增强了玫瑰叶片体内的防御蛋白活性，提高了抗虫相关次生代谢物质质量分数。综上，接种AM真菌增强玫瑰对舞毒蛾的防御，提高了玫瑰的抗虫性。