王晓慧，段佳琪，徐孝娜，张 磊，张先娇，刘寒强，杨瑞华

(1空军军医大学预防医学系健康教育与管理教研室，特殊作业环境危害评估与防治教育部重点实验室，陕西省环境健康危害评估与防护重点实验室，陕西省自由基生物学与医学重点实验室，陕西 西安 710032； 2陕西省人民医院，陕西 西安 710068)

随着人们生活方式和饮食结构的变化，我国代谢综合征(如肥胖、高血压、高脂血症和糖尿病)患病率迅速增加。越来越多的证据表明，胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)是代谢综合征的常见致病因素，被认为是所有相关代谢紊乱的最关键诱因。IR是指胰岛素敏感组织对胰岛素的反应能力减弱，在代谢性疾病的发展中起着核心作用。IR是由外周靶组织(包括肝脏、肌肉和脂肪)对正常循环浓度的胰岛素作出适当反应的能力下降引起的[1]。

高脂膳食(high fat diet，HFD)是IR的主要原因，从HFD中摄取高能量可能会导致脂肪在肝脏中沉积[2]。大量流行病学数据表明，长期食用HFD的个体IR和2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)发病率明显高于正常人群[3-4]。动物实验也证实脂肪沉积会损害胰岛素敏感器官，如肝脏[5]。研究表明，肝脏中的脂质沉积与IR密切相关[6-7]。肝脏是机体的重要器官，葡萄糖和脂质的摄取和利用主要发生在肝脏，脂肪酸摄入增加和/或脂质氧化能力降低是肝脏脂质积聚的主要原因[8-9]。

研究显示，冷暴露也可以改善小鼠的葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性[10-11]。冷暴露可以快速增加能量消耗，促进体内有氧氧化，增加脂蛋白脂肪酶的活性和脂肪酸的β氧化，从而减少脂肪沉积[12]。肝脏中脂肪积聚的减少可能会增加细胞膜上胰岛素受体(insulin receptor，INSR)与胰岛素的结合活性，并改善IR[13]。笔者前期的研究结果也显示[14-15]，慢性间断性冷暴露(chronic intermittent cold exposure，CIC)可保护肝脏免于HFD诱导的氧化应激，可能对预防和治疗代谢性疾病有益。在本研究中，通过给大鼠喂食HFD建立IR大鼠模型，观察CIC干预对HFD诱导的IR的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雄性SD大鼠24只，体质量为160～200 g，由空军军医大学实验动物中心提供(许可证号：IACUC-20210740)。大鼠自由饮水和进食，实验开始前适应性喂养1周。

1.1.2 药品与试剂 标准饲料由空军军医大学实验动物中心提供。高脂饲料(货号H10045，脂肪供能比为45%的高脂纯化饲料)购自北京华阜康生物科技股份有限公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)检测试剂盒(货号A003-1-2)购自南京建成生物工程研究所；BCA蛋白检测试剂盒(货号JL10692)、胰岛素检测试剂盒(货号P0012)购自上海江莱生物科技有限公司；p-Aktser473抗体(货号9271S)、Akt抗体(货号9272)购自Cell Signaling Technology公司；β-actin抗体(货号YM3028)购自ImmunoWay Biotechnology公司；HRP标记抗兔IgG(货号ZB-2301)、HRP标记抗小鼠IgG(货号ZF-0312)购自北京中杉金桥生物有限公司。

1.1.3 仪器设备 离心机(Eppendorf 5424R，德国)；酶标仪(lab systems MK3，美国)；化学发光仪(UVP ChemiDoc-it 410，美国)；血糖仪(ROCHE，活力型，德国)；IKA电动匀浆器(T10，德国)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分组与处理 雄性SD大鼠24只，随机分为4组，每组6只。对照组：常规饲料喂养4周；CIC组：大鼠每日于4 ℃低温饲养室暴露6 h(10∶00～16∶00)，连续4周；HFD组：高脂饲料(脂肪供能比为45%的高脂纯化饲料)喂养4周；HFD+CIC组：高脂饲料喂养，每日于4 ℃低温饲养室暴露6 h(10∶00～16∶00)，连续4周。

1.2.2 硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)法检测MDA含量 机体通过酶系统与非酶系统产生的氧自由基会攻击生物膜上的多不饱和脂肪酸，使其发生过氧化反应，从而生成脂质过氧化产物，如MDA。因此测定MDA的含量可以反映机体内脂质过氧化的程度。TBA法测定MDA的原理是MDA可与TBA缩合，形成红色产物，从而通过比色来测定。

实验开始4周后，大鼠禁食12 h，给予20 g/L戊巴比妥钠麻醉，取肝脏组织，用预冷的双蒸水漂洗数次后滤纸吸干，于千分位称重台称质量。称取100 mg肝脏组织制成匀浆后取上层血清；取0.1 mL血清，根据试剂盒说明书依次加入试剂后，旋涡混匀器混匀，95 ℃水浴40 min；流水冷却后4 000 r/min离心10 min，取上清；用酶标仪进行检测，蒸馏水调零，测定A532 nm值，计算MDA浓度。

1.2.3 蛋白检测 称取肝脏组织50 mg，加入蛋白裂解液0.5 mL，电动匀浆器匀浆2次(30 s/次)，冰上裂解30 min；于4 ℃条件下12 500 r/min离心15 min，取上清；取2 μL上清进行蛋白定量：加入200 μL AB液，37 ℃孵育30 min，测定A562 nm值，做标准曲线并计算待测蛋白的浓度；用裂解液配平后进行Western blotting蛋白检测实验：配制120 g/L分离胶，50 g/L积层胶，每孔上样80 μg蛋白样品，80 V恒压电泳15 min，120 V恒压电泳80 min，转至半干转电转仪转膜30 min，TBS缓冲液洗膜5 min，室温下用50 mL/L BSA封闭液封闭2 h，加抗体稀释液稀释后的一抗于4 ℃条件下过夜，TBST缓冲液洗膜3次(8 min/次)，加二抗室温孵育2 h，TBST缓冲液洗膜3次(8 min/次)，用增强型化学发光试剂检测系统检测条带。

1.2.4 经腹腔注射葡萄糖耐量试验(intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT) 为了评估大鼠是否表现出外周血糖调节的改变，进行了IPGTT。大鼠禁食12 h，取尾血，使用血糖仪测定各组大鼠基础血糖浓度，随后于腹腔内注射D-葡萄糖(2 g/kg)。注射后于15、30、60、90、120 min时间点测定血糖浓度，并在GraphPad 5.0软件中绘制血糖曲线，计算曲线下面积(area under the curve，AUC)。

1.2.5 空腹血清胰岛素浓度测定 4周后，大鼠禁食12 h，取新鲜的大鼠血清标本，按照1∶10的比例稀释标本稀释液，冰上进行胰岛素浓度的检测。按照说明配置标准品、标本稀释液、洗涤液等，根据试剂盒说明书加入相应试剂进行反应后，检测A450 nm值。

2 结果

2.1 CIC对大鼠体质量和体内脂肪含量的影响

前期实验结果表明，CIC暴露2周后建立的冷适应模型大鼠体质量较对照组显著降低，可能是低温基础代谢率高产热增加的原因[14-15]。本实验结果表明；与对照组相比，第3周和第4周HFD组大鼠体质量显著增加，而CIC组显著降低(P<0.05);与HFD组相比(P<0.05)，HFD+CIC组大鼠体质量显著降低(P<0.05，图1A)；与对照组相比，HFD组大鼠内脏脂肪质量升高(P<0.05)；同HFD组相比，HFD+CIC组大鼠内脏脂肪质量降低(P<0.05，图1B)。

A：大鼠每周体质量大鼠内脏脂肪含量(n=4)。 aP< 0.05 vs 对照组， cP< 0.05 vs HFD组。图1 CIC暴露对大鼠体质量和体内脂肪含量的影响

2.2 CIC对HFD大鼠血清胰岛素水平的影响

用胰岛素ELISA试剂盒检测各组大鼠血清中胰岛素水平，与对照组相比，CIC组血清中胰岛素差异无统计学意义，HFD组大鼠血清中胰岛素水平明显升高(P<0.05)；与HFD组相比，HFD+CIC组大鼠血清中胰岛素水平差异无统计学意义(图2)。

图2 CIC对大鼠血清胰岛素浓度的影响(aP<0.05)

2.3 CIC能改善HFD大鼠的葡萄糖耐量

大鼠禁食12 h，腹腔注射D-葡萄糖(2 g/kg)，分别在0、15、30、60、90、120 min取大鼠尾静脉血进行血糖检测。IPGTT结果显示，HFD组大鼠IPGTT AUC显著高于对照组(P<0.05)，表明HFD大鼠糖耐量明显受损。与HFD组相比，HFD+CIC组大鼠AUC较小，糖耐量有显著改善(P<0.05，图3)。

A：腹腔注射D-葡萄糖不同时间后的血糖浓度；B：IPGTT时间-血糖AUC。AUC：曲线下面积。图3 CIC对大鼠葡萄糖耐量的影响

2.4 CIC能够减轻HFD大鼠血清和肝脏MDA的生成

MDA是脂质过氧化的最终产物，通过间接反映组织过氧化损伤程度，是反映机体潜在抗氧化能力的重要参数，也是反映脂质过氧化程度的标志[16]。TBARS比色法测定细胞内的MDA含量。与对照组相比，HFD组大鼠肝脏和血清MDA水平显著升高(P<0.05)；与HFD组相比，HFD+CIC组大鼠肝脏和血清MDA水平显著降低(P<0.05，图4)。

A：血清MDA浓度；B：肝脏MDA浓度。MDA:丙二醛。图4 大鼠血清和肝脏MDA水平

2.5 CIC对HFD大鼠肝脏胰岛素信号通路蛋白的影响

胰岛素刺激葡萄糖的作用依赖于胰岛素信号通路，这决定了IR的水平。因此，通过Western blotting分析，检测了胰岛素途径相关因子IRS1、Akt在大鼠肝脏中的表达水平。

CIC可以改善肝脏中的胰岛素信号。干预4周后，立即取大鼠肝脏，进行Western blotting分析，以确定胰岛素途径相关基因的蛋白质表达水平。Western blotting检测结果显示，与对照组相比，HFD组大鼠肝脏的p-IRS1ser307显著上调，IRS1、p-Aktser473水平显著下调(P<0.05)；CIC组大鼠肝脏p-IRS1ser307、IRS1、p-Aktser473水平并无明显改变；与HFD组相比，HFD+CIC组大鼠肝脏的p-IRS1ser307显著下调，IRS1、p-Aktser473水平显著上调(P<0.05，图5)。

A：肝脏组织p-IRS1ser307、IRS1、p-Aktser473和t-Akt蛋白水平的变化；B：p-IRS1ser307蛋白相对灰度值变化；C：IRS1蛋白相对灰度值变化；D：p-Aktser473/t-Akt蛋白相对灰度值变化。图5 CIC对大鼠肝脏胰岛素信号通路蛋白表达的影响

3 讨论

HFD尤其是富含饱和脂肪酸的饮食，由于其干扰氧化和脂肪分解过程，容易导致脂肪沉积。脂肪沉积可能损害细胞膜功能，导致脂质代谢紊乱，通过抑制葡萄糖转运和氧化导致IR[17]。IR是指包括肝脏、肌肉和脂肪在内的胰岛素敏感组织对胰岛素的反应能力降低，在T2DM和其他代谢性疾病(如肥胖和代谢综合征)的发展中起着核心作用[18]。代谢性疾病的发病机制以能量分配的进行性失调为特征，通常会导致终末器官并发症[19]。针对这种代谢失调提出的一种新方法是应用轻度冷暴露。在健康人群中，冷暴露会增加能量消耗和全身葡萄糖和脂肪酸的利用，反复暴露可以降低空腹血糖和胰岛素水平，改善饮食脂肪酸处理[20]。尽管冷暴露具有明显的治疗潜力，但目前这种刺激对人群的影响却知之甚少。现有的少数研究[20]表明，急性和反复暴露在寒冷环境中都可以提高T2DM患者的胰岛素敏感性，降低空腹血糖。

HFD被认为是IR和血脂异常的主要原因，饱和脂肪酸可诱发IR，胰岛素激素通过对胰岛素靶细胞的各种作用，在维持血糖生理水平方面发挥着重要作用。IR的发展主要与体内过量脂肪的积累有关。我们利用大鼠进行的研究发现，HFD会导致体质量增加、肝脏脂肪沉积，胰岛素水平和葡萄糖耐量受损，产生了IR。同时低温暴露作为一种干预措施，显著改善了HFD的不良影响，产生了明显的效果。CIC已被广泛用于建立冷适应研究的动物模型。之前的研究表明，大鼠于4 ℃，6 h/d，14 d即可形成冷适应，体质量增长减缓[16]，本实验也得到一致的结果，持续暴露4周，大鼠体质量和体内脂肪含量均降低(图1)。

由于HFD被证明会诱导氧化应激，也会增加机体活性氧的生成和脂质过氧化物的产生[21]。氧化还原失衡和氧化的生物大分子大量聚集与HFD诱导的多种疾病密切相关[22]。研究表明，低温可以影响氧化还原平衡，我们的结果也表明，HFD+CIC组大鼠血清和肝脏MDA水平较HFD组明显降低。

IR是指胰岛素反应性细胞对胰岛素的反应低于正常水平的一种情况，涉及胰岛素信号通路中的破坏。胰岛素信号从胰岛素与INSR结合开始，INSR是一种受体酪氨酸激酶，然后经历各种细胞内酪氨酸残基的自磷酸化，导致包括胰岛素受体底物(insulin receptor substrate，IRS)，如IRS1和IRS2在内的衔接蛋白的招募和酪氨酸磷酸化[23]。胰岛素信号转导途径的任何一个步骤的异常都可能最终阻碍骨骼肌中葡萄糖的运输，从而导致IR。HFD抑制IRS1、Akt的表达，CIC干预可逆转肝脏中这些蛋白的表达水平，通过加强胰岛素信号通路改善IR。IRS1/Akt通路与IR密切相关[24]，Akt活性的降低容易导致IR的发生和发展[25]。我们的结果也显示，HFD大鼠肝脏中Aktser473的磷酸化水平降低，经过4周的CIC，该水平得到恢复和增强。因此，CIC可以激活肝脏中的IRS1/Akt通路，保护大鼠免受HFD诱导的IR。

综上所述，本研究结果表明CIC能在一定程度上有效改善HFD诱导的大鼠肝脏氧化应激和IR，从而发挥保护作用，本研究的结果对HFD诱导的IR的防治提供了新的思路。