郝 果，董 梅，李 璐，张耀武

（1.富平县检验检测中心（陕西省羊乳产品质量监督检验中心），陕西富平 711700；2.渭南市检验检测研究院，陕西渭南 714000；3.西安市产品质量监督检验院，陕西西安 710065）

达唑是一类无臭，无味，不溶于水，微溶于丙酮或氯仿的白色或类白色粉末。其主要分为噻苯达唑、阿苯达唑、芬苯达唑、奥芬达唑和苯硫氨酯，是一类合成的抗寄生虫药物，由于其高效性和广谱性，在农业和水产养殖中被广泛用于治疗吸虫和线虫感染[1]。但不正确的使用会使其在食用动植物产品中残留，并通过食物链在人体中累积，对人体健康构成潜在的危害[2]。动物实验证明，某些达唑具有致畸和致突变的作用[3]，因此达唑被中国、美国和欧盟等多个国家和地区列为兽药残留的重要监控对象[4]，并制定了最大残留限量[5]。达唑对人体的毒性与血清白蛋白的储运功能密切相关[6]。血清白蛋白作为人和动物血浆中重要的载体蛋白，可与多种外源性物质结合，影响其在生物体中的储存、分布、代谢和毒性[7]。《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》（GB 31650—2019）中对噻苯达唑、阿苯达唑、芬苯达唑、奥芬达唑和苯硫氨酯的残留限量标准有规定，不同靶组织残留限量不一，在奶中的限量均为100 μg·kg-1[8]。

快速、准确的检测方法能对达唑的限量设置提供强有力的技术支撑。达唑常用的检测方法有很多[9-11]，主要包括气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法、气相色谱法、免疫分析法、电化学法和荧光检测法等，其中高效液相色谱-质谱联用法因普及率高、准确性好被广泛应用[12-14]。

《牛奶和奶粉中噻苯达唑、阿苯达唑、芬苯达唑、奥芬达唑、苯硫氨酯残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》（GB/T 22972—2008）样品前处理较复杂耗时，本研究参照GB/T 22972—2008，称取10 g羊奶或奶粉经溶解复原后的羊奶复原乳置于100 mL离心管中，加入30 mL乙腈，涡旋混匀，超声提取30 min，4 000 r·min-1离 心5 min，取上 清液置于40 ℃水浴上旋转蒸发至近干，然后用碳酸盐缓冲溶液定容至10 mL，过0.22 μm滤膜上高效液相色谱-质谱联用仪进行检测，同时确定了检测器条件，建立了一种准确、快速、灵敏度高的羊乳及羊乳粉中达唑含量的检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

液相色谱-质谱联用仪1290-6460（配ESI源）（美国安捷伦科技有限公司）；十万分之一天平（德国赛多利斯仪器有限公司）；百分之一电子天平（德国赛多利斯仪器有限公司）；旋涡混合器Vortex-6（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；数控超声波清洗器KQ2200DE（昆山市超声仪器有限公司）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

噻苯达唑标品（21070925，纯度99.9%，坛墨质检）；阿苯达唑标品（2502008，纯度97.2%，坛墨质检）；芬苯达唑标品（21090304，纯度99.7%，坛墨质检）；奥芬达唑标品（1371801，纯度88.0%，坛墨质检）；苯硫氨酯标品（21090311，纯度99.9%，坛墨质检）。

C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，150 A，美国安捷伦科技有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国sigma公司）；水为实验室自制超纯水。

1.2 实验方法

1.2.1 液相洗脱条件和质谱条件的选择

分离条件以GB/T 22972—2008[7]为基础，依据仪器条件和色谱柱的不同进行调整，使5个组分能完全分离。

1.2.2 样品制备方式的选择

按照提取、净化、浓缩的步骤制备试样，以回收率考察方法的准确性。回收率的计算参考GB/T 27417—2017[14]中回收率的计算。

1.2.3 定量限的测定

在羊奶和羊奶粉中添加目标化合物，做平行样，测基线噪音值，依据特征离子色谱峰rSN＞10为方法定量限，测定方法的定量限。

2 结果与分析

2.1 液相洗脱条件和质谱条件优化

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Agilent BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱温：40 ℃；流动相：A为0.1%甲酸水溶液；B为甲醇；流速：0.2 mL·min-1；进样量：1.0 μL；流动相洗脱梯度见表1。

表1 梯度洗脱程序表

2.1.2 质谱条件

电离方式：ESI+；雾化器压力：30 psi；毛细管电压：3 000 V；干燥气温度：350 ℃；干燥气流速：10.0 L·min-1；多反应监测（MRM）模式；其他参数见表2。

表2 各组分质谱分析参数表

2.2 净化条件的优化

由于羊奶及羊奶粉中含有大量的蛋白质以及脂类物质，容易形成基质干扰，因此必须对其进行净化处理，以减少基质效应。净化的方式主要有液液分配和固相萃取两种方式。研究分别比较了乙腈直接提取旋转蒸发后定容过滤膜上机测定和经C18固相萃取柱净化氮吹定容过滤膜上机测定。结果显示，C18固相萃取柱的回收率较低，没有乙腈提取旋转蒸发后定容直接过滤膜的回收率高，因此选择乙腈直接提取的方式。

2.3 样品处理

羊奶样品称样10 g（精确至0.01 g）于100 mL具塞离心管中，加入30 mL乙腈，涡旋混匀3 min，超声30 min，以4 000 r·min-1离心5 min，于40 ℃水浴旋转蒸发除去有机溶剂，用碳酸盐缓冲溶液定容至10 mL。过0.22 μm滤膜供高效液相色谱质谱联用仪分析。同时做平行试验和空白试验。

羊奶粉样品称取12.5 g于烧杯中，加适量35～45 ℃水将其充分溶解，待冷却至室温后，加水至100 g，混匀，其余步骤同羊奶。

2.4 线性范围、线性方程

以峰面积y为纵坐标，标准品质量浓度x为横坐标，进行线性回归，建立回归方程，各组分回归方程如表3所示。

表3 各组分标准曲线回归方程表

结果表明，阿苯达唑、芬苯达唑、噻苯达唑、奥芬达唑和苯硫氨酯在10.08～584.00 ng·mL-1相关系数R2＞0.999，浓度与峰面积呈线性关系，线性良好，符合要求。

2.5 重复性

平行称取6份羊奶样品和羊奶粉样品，加入同一水平的5组分标准物质，按照2.3进行样品处理，2.1条件进行测定，计算变异系数，结果见表4、表5。结果表明变异系数均在1.76%～5.08%，实验结果符合GB/T 27404—2008、GB/T 22972—2008中试样测试结果的重复性要求。

表4 羊奶样品重复性实验结果

表5 羊奶粉样品重复性实验结果

2.6 精密度

将混合标准系列4重复测定6次，计算相对标准偏差，结果见表6，变异系数在2.23%～6.40%，实 验 结 果 符 合GB/T 27404—2008、GB/T 22972—2008中试样测试结果的重复性要求。

表6 精密度实验结果

2.7 定量限和检出限

称取2份羊奶空白样品，准确加入各组分标准溶液至检出限浓度，即0.01 mg·kg-1，按照2.3的操作，通过比较分析物样品与空白样品测量的信号，以验证标准给出的方法检出限，可接受的信噪比在3∶1以上，为可用检出限，按2.3操作，2.1测定，信噪比值在57.20 ～ 456.14。经验证，羊奶中的噻苯达唑、阿苯达唑、芬苯达唑、奥芬达唑和苯硫氨酯的检出限 为0.01 mg·kg-1，满 足GB/T 22972—2008对5种组分检出限的要求。

称取奶粉样品12.5 g，按照2.3处理样品方法加水溶解后，加入各组分标准溶液至检出限浓度，即0.08 mg·kg-1，通过比较分析物样品与空白样品测量的信号，以验证标准给出的方法检出限，可接受的信噪比在3∶1以上，为可用检出限，按2.3操作，2.1测定，信噪比值在47.59 ～ 447.48。经验证，羊奶及羊奶粉中的噻苯达唑、阿苯达唑、芬苯达唑、奥芬达唑、苯硫氨酯的检出限为0.08 mg·kg-1，满足GB/T 22972—2008对5种组分检出限的要求。

2.8 回收率

称取羊奶空白试样10.00 g，加入低、中、高3个水平的5种标准物质，按照2.3处理样品，2.1进行测定，计算回收率。称取奶粉样品12.5 g，按照2.3处理样品方法加水溶解后，加入低、中、高3个水平的5种标准物质，按照2.3操作，2.1测定，计算回收率。回收率=（实测值-本底值）/加标量×100%。

羊奶中3个浓度，结果见表7，回收率范围61.06%～114.51%，羊奶粉中3个浓度，结果见表8，回收率范围80.18%～115.72%，两者回收率结果符合GB/T 27404—2008、GB/T 22972—2008中对回收率的要求。

表7 羊奶样品中回收率实验结果表

表8 羊奶粉样品中回收率实验结果表

2.9 样品检测结果

按照前述的液相色谱-质谱联用方法对2份质控样品进行检测，结果均在范围内。制备加标羊乳样品进行分析，样品中5种组分能够完全分离，无干扰峰，且分析时间很短。说明该方法运用到实际样品的检测中可以得到较好的分离分析结果。样品分析色谱图见图1。

图1 达唑类标准溶液的TIC色谱图

3 结论

羊奶样品称样10 g于100 mL具塞离心管中，加入30 mL乙腈，涡旋混匀3 min，超声30 min，以4 000 r·min-1离心5 min，移取上清液于40 ℃水浴旋转蒸发除去有机溶剂，用碳酸盐缓冲溶液定容至10 mL，过0.22 μm滤膜供高效液相色谱质谱联用仪分析。羊奶粉经水溶解复原后同羊奶。同时做平行试验和空白试验。经过优化选择，液相色谱条件为Agilent BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱温：40 ℃；流动相：A为0.1%甲酸水溶液；B为甲醇；流速：0.2 mL·min-1；进样量：1.0 μL。质谱条件为电离方式：ESI+；雾化器压力：30 psi；毛细管电压：3 000 V；干燥气温度：350 ℃；干燥气流速：10.0 L·min-1；多反应监测（MRM）模式，通过测定线性范围、重复性、精密度、加标回收实验以及检出限、定量限的验证，均得到了满意结果。本方法前处理简单，节约试剂耗材，用时短，优于国标方法，说明本检测方法灵敏度高、准确性好，能很好地测定乳粉中的达唑含量。