刘倩颖 张 美

江苏省南京市江宁医院 211100

糖尿病肾病(DN)是机体长时间高糖状态导致的蛋白尿以及肾小球滤过率进行性降低，是糖尿病的常见并发症和主要死亡原因之一，严重威胁患者的生命安全[1]。临床对DN的病因和发病机制认识尚不完全，目前主要认为与遗传因素和糖代谢异常、肾脏血流动力学改变以及免疫炎症因子等有关。相关研究表明，机体免疫平衡中的Th1/Th2细胞平衡可能影响患者糖尿病肾病发展进程，Th1细胞和Th2细胞是由T辅助细胞(CD4+细胞)根据机体发生不同优势免疫应答分泌的细胞因子不同分化而来，生理条件下,机体的Th1细胞和Th2细胞维持一定比例，从而保持人体免疫平衡，当患者发生免疫异常时，CD4+细胞的分化偏向其中一方，Th1/Th2平衡发生变化[2]。磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)PI3K和蛋白激酶B(PKB/AKT)已被证实是体内关键的胰岛素信号分子，PI3K-AKT信号通路能促进胰岛素刺激的葡萄糖摄取与储存，在有胰岛素刺激的情况下，可启动PI3K-AKT信号途径，解除对糖原合酶(GS)的抑制，促进糖原的合成[3]。因此，本文通过对比健康体检者与DN患者血清中Th1/Th2细胞平衡的变化和血清中PI3K、AKT浓度差异，探究糖尿病肾病患者外周血中Th1/Th2变化及其与PI3K/AKT通路的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2020年9月—2021年9月我院治疗的糖尿病肾病患者100例为观察组，其中男48例，女52例，平均年龄(51.25±7.86)岁，体质指数23.45±3.36。选取同期来我院体检的78例健康者为对照组，其中男38例，女40例，平均年龄(51.84±7.43)岁，体质指数23.18±3.42。两组一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。本研究已通过医院医学伦理委员会审批。

1.2 选择标准 纳入标准：(1)糖尿病肾病的诊断参照中华医学会糖尿病学分会2014年制定的《糖尿病肾病防治专家共识》；(2)对本次研究内容知情并签署知情同意书者。排除标准：(1)合并其他严重慢性疾病或恶性肿瘤者；(2)严重精神障碍或沟通障碍无法配合治疗者；(3)合并自身免疫疾病或感染者；(4)合并心衰、酮症酸中毒等严重并发症者。

1.3 方法

1.3.1 Th1/Th2细胞水平测定：(1)测定原理：Th1细胞主要分泌γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)和肿瘤坏死因子-β(TNF-β)，介导细胞免疫应答；Th2细胞主要分泌白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5、白细胞介素-10等，介导体液免疫反应。由于生理状况下T细胞未受到刺激，所分泌的细胞因子非常少，可忽略不计，而IFN-γ是Th1分泌的最特异的细胞因子，IL-4是Th2分泌的最特异的细胞因子。因此在测定Th1/Th2细胞水平时，可采用Th1细胞分泌的细胞因子IFN-γ与Th2细胞分泌的细胞因子IL-4的比值近似表达Th1/Th2比率。(2)具体步骤：①标本采集：所有观察对象均于早晨采集空腹静脉血6ml，取3ml外周静脉血于肝素钠抗凝管，加入淋巴细胞分离液，离心(3 000r/min,10min)后，取外周血单个核细胞(PBMC)悬液，稀释PBMC悬液至1×107/ml，将稀释后的PBMC加入细胞培养板，然后向培养板内加入250×PMA/lonomycin和 250×Monensin/BFA，将其混合均匀后放入充满5%浓度CO2恒定温度37℃的培养箱中培养6h。然后加入anti-CD3 FITC和anti-CD4 PERCP对PMBC表面抗原染色，采用 FIX&PERM Reagent A破膜，用anti-IFN-γAPC和anti-IL-4 PE做细胞内因子染色，用同型IgG抗体对照，以流式细胞仪(购自美国贝克曼公司，型号：FC500A)检测INF-γ的 CD4细胞、IL-4的CD4细胞所占百分比，近似代表Th1、Th2所占百分比。②取3ml外周血置于促凝管中，离心(3 000r/min,10min)后，取上清与无菌EP管中，使用IL-4和 IFN-γ 的 ELISA 试剂盒(杭州赛基生物科技公司成品试剂盒)检测细胞因子IFN-γ、IL-4的外周血表达水平，具体步骤按照说明书进行。

1.3.2 PI3K/Akt通路测定：(1)提取总RNA：所有受试者均于清晨抽取空腹静脉血2ml，3h内完成总RNA提取,后冻存于-80℃冰箱中。采用RNA提取试剂盒(吸附柱法)提取总RNA，采用紫外—可见分光光度法测定Z总RNA的浓度和纯度，应用琼脂糖凝胶(1.5%)电泳(180mV,5min)，判定RNA完整性，取400ng总RNA待用。(2)逆转录聚合酶链反应与相对定量评估：采用逆转录试剂盒和Oligod(T)逆转录RNA，反应条件为42℃水浴20min+95℃水浴3min，反应结束后将其生成物保存与-80℃，等待检测。用QuantiFast ProbeAssays、QuantiFast ProbePCRKit(均购自QiagenCo,Gemany)和ABIPrism7500型PCR仪(ABI公司)进行实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)。探针测定AKT1引物、HsAKT1PQF1QuantiFast与PI3KCB引物、HsPI3KCBQF1QuantiFast,应用GADPH引物及探针为内部对照，PCR反应体系：总体积25μl,反应条件为40个循环，94℃预变性 5min,94℃变性30s，65℃退火30s。均平行测定3次后获取平均Ct值,按Ct值对斜率及截距进行计算,并绘制标准曲线。采用双标准曲线法对PI3KmRNA及AKTmRNA表达水平进行分析。

1.4 评价标准 (1)对比两组外周血中IFN-γ及IL-4的表达水平；(2)对比分析两组患者外周血中 Th1/Th2 细胞比例变化；(3)对比分析两组外周血中PI3K mRNA、AKT mRNA的表达水平；(4)比较糖尿病肾病患者外周血IFN-γ、IL-4水平与PI3K mRNA、AKT mRNA的相关性。

2 结果

2.1 两组外周血IFN-γ、IL-4水平比较 观察组的IFN-γ水平均较对照组高，IL-4水平较对照组低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组外周血IFN-γ、IL-4水平比较

2.2 两组外周血中Th1/Th2细胞比例比较 观察组外周血Th1细胞多于对照组，Th2细胞对照组低，Th1/Th2较对照组高，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 两组患者外周血中Th1/Th2细胞比例比较

2.3 两组外周血PI3K mRNA、AKT mRNA比较 观察组外周血中PI3K mRNA、AKT mRNA水平均高于对照组(P<0.05)。见表3。

表3 两组外周血PI3K mRNA、ATK mRNA表达水平比较

2.4 IFN-γ、IL-4水平及Th1/Th2值与PI3K mRNA、AKT mRNA的相关性 外周血IFN-γ水平与PI3K mRNA、AKT mRNA均呈正相关(r=0.131、0.032，P<0.05)，外周血IL-4水平与PI3K mRNA、AKT mRNA均呈负相关(r=-0.132、-0.212，P<0.05)。

3 讨论

免疫因素是糖尿病及其并发症的一个重要因素，天然免疫中补体系统和模式识别受体之间关系密切、相互作用机制繁杂，在糖尿病肾病的发病过程中有关键性作用[4]。T细胞根据其分泌的细胞因子和功能不同，在外界因素的刺激下，分化为Th1细胞和Th2细胞，Th1/Th2细胞平衡是维持机体健康的重要免疫机制，两种细胞互为抑制，处于动态平衡中。研究表明，Th1/Th2细胞平衡与糖尿病肾病关系密切，Th1细胞可促进糖尿病的发生，而Th2细胞对糖尿病有保护作用[5]。PI3K/AKT信号通路作为调控细胞增殖、转运和生存的重要通路，可以从整体上降低细胞的生长阻碍和细胞凋亡，并提高细胞的存活能力和繁殖能力[6]。有研究证实PI3K/AKT信号通路是胰岛素的主要信号通路，胰岛素刺激引起PI3K信号传导途径的作用下降，使用PI3K/AKT 信号通路抑制剂能够引起胰岛素抵抗[7]。

本文通过对比分析两组患者外周血IFN-γ、IL-4水平和Th1/Th2变化,结果显示观察组患者Th1细胞占比及Th1/Th2均较对照组高，而Th2细胞占比较对照组低。提示在糖尿病肾病患者中Th1细胞参与炎症反应过程，体内IFN-γ等炎症因子水平升高，促进糖尿病肾损伤的发生，而IL-4水平在这一过程中有降低。在DN患者肾损伤过程中，细胞免疫反应较体液免疫反应更占据优势，IFN-γ升高促进B淋巴细胞活化，导致NK细胞过度激活进而过度损伤胰岛β细胞，导致糖尿病肾病。比较两组外周血PI3K mRNA、AKT mRNA水平，结果表明观察组外周血中PI3K mRNA、AKT mRNA水平均高于对照组，将其与外周血IFN-γ、IL-4细胞水平进行相关性分析，结果表明外周血INF-γ水平与PI3K mRNA、AKT mRNA均呈正相关，外周血IL-4水平与PI3K mRNA、AKT mRNA均呈负相关。糖尿病肾病患者外周血中PI3K mRNA和AKT mRNA水平均高于健康对照组，提示PI3K/AKT信号通路的表达与糖尿病肾病进展相关。这与祝再然等[8]的研究结论一致，认为PI3K通过激活其下游的重要靶蛋白AKT进一步调节下游信号分子参多种生理病理活动，在糖代谢过程中，胰岛素可激活胰岛β细胞内蛋白酪氨酸激酶(PTK)，进而通过胰岛素受体底物蛋白(IRS)激活PI3K，而PI3K可以激活其下游信号分子AKT,激活AKT后通过将细胞内葡萄糖运载体囊泡转移固定到细胞膜从而发挥降低血糖的作用。而Th1细胞因子(IFN-γ)通过促进PI3K/AKT信号通路的表达来促进糖尿病肾病进展。而Th2细胞因子(IL-4)与PI3K mRNA和AKT mRNA水平呈负相关，提示Th2细胞因子可能通过抑制PI3K/AKT信号通路来预防或延缓糖尿病患者肾损伤的发生。

综上所述，糖尿病肾病患者外周血Th1细胞水平升高，而Th2细胞水平下降，且Th1/Th2水平升高可能过度激活PI3K/AKT信号通路，导致糖尿病肾病。