高志浩，张佳玥，刘阳，王金丹，张旭，张莹，王秋菊，孙金艳，刘国君，刘胜军

（1.黑龙江八一农垦大学，大庆 163319；2.黑龙江省农业科学院）

鹅是季节性繁殖动物，其繁殖活动的季节性源自其自身内源性生物节律与环境变化的相互作用，光周期是指昼夜周期中光照期和暗期长短的交替变化，是影响鹅生产最重要的环境因素之一[1-2]。光周期会影响鹅Clock基因的表达[3]，也会引起下丘脑、垂体、卵巢中繁殖相关基因表达水平的变化[4]。自然光周期情况下，我国南北方鹅种表现出不同的繁殖节律，但都表现为休产期、产蛋初期、产蛋高峰期及产蛋末期四个繁殖阶段。

探究鹅Clock基因和下丘脑、垂体、卵巢中繁殖相关基因表达水平的变化对阐明鹅季节性繁殖行为的分子机制有着重要的理论指导意义。鸟类季节性繁殖的调控机制非常复杂，光周期调控鸟类季节性繁殖的初步机制是：鸟类下丘脑光感受器首先感知光信号[5]，诱导垂体结节部分泌促甲状腺激素释放激素（thyrotropin releasing hormone，TSH）[6]；TSH作用于下丘脑基底部的室管膜细胞，使其分泌甲状腺激素激活酶Ⅱ型脱碘酶，催化甲状腺素（thyroxin，T4）转化为三碘甲状腺原氨酸（triiodothyronine，T3）[7]，启动促性腺激素释放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH）的合成和分泌[8]；GnRH经血液循环作用于垂体，刺激促性腺激素—促黄体素（luteinizing hormone，LH）和促卵泡素（follicle-stimulating hormone，FSH）的合成和分泌[9]；LH和FSH促进性腺发育成熟，禽类进入繁殖状态，开始产卵[10]。在禽类产蛋后期，光信号诱导下丘脑室旁核分泌促性腺激素抑制激素（Ggonadotropin-releasing hormoneGnIH）[11]，垂体前叶分泌催乳素（prolactin，PRL）[12]，抑制LH的分泌，反向调控繁殖活动[13]；PRL还可以与卵巢上PRL受体结合直接抑制卵泡发育，导致卵泡闭锁[14]；PRL的释放激素—血管活性肠肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）可以促进禽类PRL的分泌，增强PRL的功能[15]；卵巢卵泡发育产生的雌二醇（estradiol，E2）也可以提高PRL水平[16]。最终在多种激素协同作用下，停止产卵。PRL是禽类繁殖活动发生季节性退化或产蛋季节终止的主要原因[17]。

Clock基因是动物内源性节律变化的核心，Zhang等[18]对亚洲短趾百灵的研究表明，Clock基因通过影响繁殖相关激素的分泌调控鸟类的繁殖期。Shi等[19]关于马岗鹅的研究表明，繁殖期LH、睾酮的血清浓度高于休产期，PRL则相反；增加光照，LH、FSH的血清浓度下降，PRL上升，减少光照则相反。Huang等[20]关于马岗鹅在一个繁殖周期中繁殖相关激素血清浓度变化的研究结果与Shi等类似；增加光照，下丘脑VIP基因、垂体PRL基因表的达水平上升，但下丘脑GnRH基因、垂体LH基因的表达水平无明显下降。Zhu等[21]关于扬州鹅的研究表明，增加光照，扬州鹅下丘脑中GnRH基因的表达水平上升，GnIH基因、VIP基因下降；垂体中FSH基因、LH基因，睾丸中FSHR基因、LHR基因的表达水平上升。当出现光不应现象后，扬州鹅下丘脑中GnIH基因、VIP基因、垂体中VIPR基因、PRL基因的表达水平上升。Yang等[22]关于扬州鹅的研究表明，繁殖期FSH基因的表达水平，LH、FSH的血清浓度均高于休产期；但是繁殖期PRL的血清浓度也高于休产期，这与Zhu等的研究结果不同。

关于光周期调控马岗鹅、扬州鹅等南方短日照或部分长日照类型鹅种繁殖相关激素分泌及基因表达水平的研究较多，但光周期如何影响北方完全长光照类型成年鹅种，及各繁殖阶段繁殖轴（Hypothalamic pituitary gonadal axis，HPG）相关基因表达水平的变化则鲜有研究。试验以长光照类型东北地方鹅种东北白鹅为研究对象，测定鹅群的产蛋活动，采集一个繁殖周期不同时期东北白鹅下丘脑、垂体、卵巢组织样本，检测不同时期繁殖相关基因的表达水平，探究不同繁殖阶段HPG轴繁殖相关基因表达及生殖激素变化的规律，为进一步阐明北方长光照鹅种季节性繁殖行为的分子调控机制提供支持。

1 材料与方法

1.1 试验动物

选取黑龙江大庆某鹅场同一批次已完成一个自然产蛋周期（2017年6月20日孵化出壳，2018年2月20日开始产蛋，7月20日产蛋结束）的健康东北白鹅母鹅600只，在鹅群自然光照、正常饲喂的情况下，经选择淘汰，选留健康东北白鹅500只，鹅群于2019年2月25日重新开产，7月初产蛋结束。

1.2 样本采集

分别在休产期（2019年1月15日）、产蛋前期（2019年3月20日，产蛋率低于20%）、产蛋高峰期（2019年5月1日，产蛋率30%以上）、产蛋后期（2019年7月1日，产蛋率20%以下）四个阶段选取健康雌性东北白鹅各5只，采集血样，离心获得血清，-20℃冰箱保存；采集下丘脑、垂体、卵巢组织的样本，液氮冻存，-80℃冰箱保存。

1.3 激素浓度测定

采用上海优选生物科技有限公司（中国）商用试剂盒测定血清中LH、FSH和PRL的浓度。

1.4 总RNA提取与cDNA制备

用5 min极速RNA提取试剂盒（新海基因，哈尔滨）提取不同组织总RNA；用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（TAKARA，日本）制备cDNA，-20℃冰箱保存。

1.5 引物设计与合成

参考的禽类基因序列来自NCBI，用Primer premier 5.0软件设计简并引物（表1）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 HPG轴各器官测定的基因及引物信息Table 1 Gene tested in HPG axis and its primer information

1.6 东北白鹅下丘脑、垂体、卵巢中繁殖相关基因表达定量分析

1.7 数据分析

基因表达水平以平均数±标准误表示，用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA），P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。以休产期各基因的相对表达水平为1.00。

2 结果与分析

2.1 不同繁殖阶段东北白鹅下丘脑中Clock基因和繁殖相关基因表达情况

下丘脑中Clock基因和繁殖相关基因在不同繁殖阶段的表达水平如图1所示，由图1可知，Clock基因在产蛋高峰期的表达水平显著高于产蛋后期（P<0.05）；GnRH基因的表达水平在试验期内呈下降趋势，在休产期的表达水平与产蛋后期差异显著（P<0.05）；VIP基因在产蛋高峰期的表达水平显著高于产蛋后期（P<0.05）。

图1 不同繁殖阶段下丘脑Clock基因和繁殖相关基因mRNA相对表达水平Fig.1 Relative expression level of Clock gene and reproductive related genes mRNA in different periods in hypothalamus

2.2 不同繁殖阶段东北白鹅垂体中相关基因表达情况

垂体中相关基因在不同繁殖阶段的表达水平如图2所示，由图2可知，LH基因在休产期的表达水平极显著低于产蛋期（P<0.01）；FSH基因的表达水平在产蛋高峰期及之前呈上升趋势，差异极显著（P<0.01），在产蛋后期下降，极显著低于产蛋高峰期（P<0.01）；PRL基因在产蛋高峰期及之前的表达水平极显著低于产蛋后期（P<0.01）。

图2 不同繁殖阶段垂体繁殖相关基因mRNA相对表达水平Fig.2 Relative expression level of reproductive related genes mRNA in different periods in pituitary

2.3 不同繁殖阶段东北白鹅卵巢中繁殖相关基因表达情况

卵巢中繁殖相关基因在不同繁殖阶段的表达水平如图3所示，由图3可知，LHR基因表达水平的变化差异不显著（P>0.05）；FSHR基因在产蛋高峰期的表达水平极显著高于产蛋后期（P<0.01），变化趋势与Clock基因相似。

图3 不同繁殖阶段卵巢繁殖相关基因mRNA相对表达水平Fig.3 Relative expression level of reproductive related genes mRNA in different periods in ovary

2.4 不同繁殖阶段东北白鹅血清中繁殖相关激素浓度变化情况

血清中繁殖相关激素在不同繁殖阶段的浓度变化如图4所示，由图4可知，LH在繁殖期的血清浓度极显著高于休产期（P<0.01），在产蛋高峰期极显著高于产蛋前期和产蛋后期（P<0.01）；FSH在产蛋后期的血清浓度极显著高于休产期和产蛋前期（P<0.01），在产蛋高峰期极显著高于产蛋后期（P<0.01）；PRL血清浓度差异不显著（P>0.05）。

图4 不同繁殖阶段血清LH，FSH和PRL的变化Fig.4 Serum levels of reproductive hormones in different periods

3 讨论

籽鹅和东北白鹅是黑龙江省两个主要的地方鹅种，目前对籽鹅繁殖性状的研究较多，但对于体型相对较大的东北白鹅的研究较少。

Clock基因是动物内源性节律变化的核心元件，Agarwal等[23]的研究表明，光周期的改变会引起下丘脑中Clock基因表达水平的变化。试验中，东北白鹅下丘脑中Clock基因表达水平随光周期的变化而变化，变化趋势与产蛋曲线相同，在产蛋高峰期及之前逐渐上升，在产蛋后期下降。劳永聪等[24]关于马岗鹅的研究表明，Clock基因在产蛋高峰期的下丘脑中高表达，与试验结果一致，说明该基因可能参与鹅繁殖节律的调控。但马岗鹅在光照逐渐缩短的11月份产蛋，东北白鹅在光照逐渐增加的春季产蛋，这表明Clock基因的表达水平与光周期关系不大。Renthlei等[25]研究表明，在全暗的条件下，Clock基因的表达水平依然呈现出节律性变化，这表明Clock基因表达水平的节律性变化并不依赖于光周期。Guh等[26]认为，不论长光照还是短光照鸟类，都对光照时长的变化非常敏感，存在一个关键日照时长和光可诱导相位，一旦光照时间和光可诱导相位重合，便可诱导繁殖过程，而Clock基因则参与产生光可诱导相位过程。因此可以认为，Clock基因的表达具有内源性特征，进一步的研究表明Clock基因通过调节动物代谢通路中基因的表达、激素的分泌调节动物的代谢，进而影响动物的行为，包括采食、繁殖等[27]。

GnRH基因的表达与鸟类内源性生物节律有关。在本次试验中，下丘脑的GnRH基因在产蛋高峰期及之前，表达水平均高于产蛋后期。Moore等[28]指出鸟类进入春季繁殖季节时，下丘脑视前区GnRH的含量增加，GnRH活性增加会刺激垂体前叶释放FSH和LH，促性腺激素会诱导性腺生长并释放作用于大脑以调节繁殖行为的性激素。Parhar等[29]指出GnRH是一种关键的下丘脑神经肽，可刺激垂体释放促性腺激素，促性腺激素可刺激性腺中性激素的分泌，性激素可调控脊椎动物的社会行为，而社会行为是繁殖的关键组成部分。Zhang等[30]研究表明，卵巢颗粒细胞的增殖呈剂量依赖性受GnRH激动剂和拮抗剂的影响，GnRH可能通过与细胞连接相关的自分泌或旁分泌途径直接调节卵巢颗粒细胞增殖，GnRH可能通过改变参与卵巢颗粒细胞中cAMP积累、排卵周期和细胞连接的基因的表达，在卵泡发育中发挥作用。这些研究表明，GnRH基因在开产前、产蛋前期、产蛋高峰期的高表达，是受到内源性生物节律的调节，参与繁殖活动的开始与持续，一方面参与繁殖轴相关激素水平的调控，另一方面直接调控卵泡的发育；GnRH基因在产蛋后期的低表达，一方面可能是东北白鹅内源性生物节律的调节，另一方面可能是发挥终止繁殖活动作用的VIP基因和PRL基因表达升高的影响。

FSHR在繁殖期间，介导鹅卵巢对FSH的反应。在本次试验中，卵巢中LHR基因表达水平的变化差异不显著；FSHR基因在产蛋高峰期的表达水平高于产蛋后期。Zhu等[31]研究表明，低浓度的PRL可以促进LHR基因的表达，从而增强LH的功能，高浓度的PRL会抑制LH的分泌。这可能是LHR基因表达水平的变化趋势与PRL血清浓度的变化趋势相反的原因。Cui等[32]研究表明，FSH可以诱导FSHR基因的表达。这可能是FSHR基因表达水平的变化趋势与FSH血清浓度的变化趋势相同的原因。

在鸟类中，光周期调控繁殖节律最终由垂体分泌促性腺激素和PRL实现。在试验中，垂体中LH基因在休产期的表达水平低于产蛋期；FSH基因的表达水平在产蛋高峰期及之前呈上升趋势，在产蛋后期下降；下丘脑的VIP基因和垂体的PRL基因均是在产蛋末期时表达水平达到巅峰；FSH在产蛋后期的血清浓度极显著高于休产期和产蛋前期，在产蛋高峰期极显著高于产蛋后期；LH在繁殖期的血清浓度极显著高于休产期，在产蛋高峰期极显著高于产蛋前期和产蛋后期；PRL血清浓度差异不显著。光照时间的增加首先刺激LH的分泌，进而刺激性腺发育，鸟类开始繁殖，然后PRL开始分泌，推动光不应期现象的发展，达到一定程度后，LH分泌减少，性腺开始退化[33]。Yang等[34]发现，GnRH可促进鹅LH、FSH的合成。Palermo等[35]研究表明，FSH通过调控卵巢小卵泡的发育促进雌激素的分泌，LH调控大卵泡的发育和成熟。Bahr等[36]研究表明，FSH主要控制较不成熟（较小）卵泡的成熟，刺激较小排卵前卵泡的颗粒细胞分泌孕酮，LH主要用作促排卵。这些结果表明，FSH基因、LH基因表达水平和血清浓度受GnRH的调控，但GnRH基因表达的变化趋势与FSH基因、LH基因表达水平和血清浓度的变化趋势不尽相同，FSH基因和LH基因与CLOCK基因在产蛋高峰期的同样高表达，表明FSH和LH的分泌可能受到内源节律的调控。Dawson等[37]研究表明GnRH调控LH的产生和分泌，下丘脑分泌VIP时会促进垂体分泌PRL。Rozenboim等[38]的研究表明，PRL通过作用于下丘脑和垂体前叶抑制其自身的分泌，通过降低下丘脑中GnRH的水平降低LH的水平。

4 结论

Clock基因、LH基因、FSH基因和FSHR基因表达水平的变化趋势与东北白鹅产蛋曲线的变化相似，从休产期、产蛋前期到产蛋高峰期，逐渐升高，在产蛋后期降低。东北白鹅下丘脑、垂体、卵巢中Clock基因和繁殖相关基因的表达水平与鹅的产蛋节律密切相关。血液中FSH和LH在产蛋高峰期的浓度明显高于繁殖期的其他阶段和休产期。