隋 御，王 媛，李元杰，彭 亮，徐 方

（1.宁夏医科大学基础医学院，银川 750004；2.宁夏医科大学生育力保持教育部重点实验室，银川 750004；3.宁夏医科大学总医院皮肤科，银川 750004）

结肠癌（cancer of colon）在世界范围是发病率较高的恶性肿瘤之一，我国结肠癌发病率和死亡率均呈上升趋势，2020年全球癌症统计显示，我国结肠癌新发率和死亡率分别居恶性肿瘤第三和第五位[1]。目前对结肠癌的治疗以手术为主、化放疗为辅[2]。铂类药物由于其药物活性高、治疗效果好，可以和其他抗肿瘤药物联合使用，因此在肿瘤治疗领域得到广泛应用。但肿瘤细胞对于铂类药物的耐药性也越来越被人们关注。近年来通过研究肿瘤细胞对铂类抗肿瘤药物的耐药机制，来降低其耐药性，提高肿瘤的治疗效果。

DNA聚合酶ι（DNA polymerase iota，polι）作为Y家族DNA聚合酶中保真性较低的基因，其复制保真度比高保真DNA聚合酶低103~104倍[3]，低保真度的积累会导致基因突变，进而诱导肿瘤的发生。有研究[4]证实，polι基因在消化道肿瘤细胞中表达活跃，该基因与肿瘤细胞的耐药性也有一定的关联性[5]。本研究通过RNA干扰技术下调人类结肠癌肿瘤细胞SW480中polι基因的表达，并结合肿瘤治疗药物奥沙利铂，探讨polι基因与肿瘤治疗药物联合作用对肿瘤细胞增殖与凋亡的影响，为肿瘤临床治疗提供前期理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

人类结肠癌细胞SW480采购于中科院上海细胞库，细胞培养使用含10%胎牛血清与1%青-链霉素的1640培养液，于5%CO2、37℃的无菌培养箱中常规培养。胎牛血清购自Biological Industries公司，1640培养基购自Gibco公司，RNA干扰用的Lipofectamine RNAiMAX试剂购自赛文公司，目的基因及对照组所使用的RNA干扰片段由上海生工技术有限公司设计并合成，目的基因及管家基因引物由通用生物系统有限公司设计并合成，RNA提取试剂购自全式金生物有限公司，反转录试剂购自TaKaRa公司，定量PCR试剂购自Vazyme公司，Taq DNA聚合酶购自加拿大Fermentas公司，Annexin V-APC/7AAD细胞凋亡试剂盒购自联合生物有限公司，MTT与CCK-8试剂盒购自赛文公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA序列的设计与合成 根据从Gen-Bank中查找的polι基因（Gene ID:11201）编码序列，结合RNA干扰设计原则，采用美国Dharmacon公司的网上设计软件，由上海生工技术有限公司合成能使目的基因polι低表达的siRNA基因表达序列，见表1。

表1 polι干扰序列

1.2.2 干扰片段的转染与实验分组 按Lipofectamine RNAiMAX说明书操作进行干扰片段的转染。实验细胞分为6个组：1）空白组：未经任何处理的SW480细胞；2）对照组：转染阴性对照片段的SW480细胞；3）实验组：转染SiRNA干扰片段，可以降低polι基因表达的SW480细胞；以上各组细胞常规培养24 h后给予奥沙利铂处理24 h后更换普通培养基，成为空白加药组、对照加药组和实验加药组，再进行后续实验。

1.2.3 Real time-PCR检测polι基因表达 利用TRIzol法分别提取实验组、对照组和空白组细胞的总RNA，检测和使用反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，对cDNA中的polι基因进行实时荧光定量PCR检测，polι基因和GAPDH基因的上游引物序列见表2。扩增体系按照TB GreenRPremix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）试剂盒说明操作，7500FAST检测基因表达情况，所得数据通过比较CT值法（2-△△ct）进行相对定量分析。

表2 polι和GAPDH引物扩增序列

1.2.4 MTT法确定药物给药剂量 根据课题组前期实验结果、结合预实验结果设置5个实验（奥沙利铂）药物浓度梯度：1.25、2.50、5.00、10.00和20.00 μg·mL-1。将对数生长期的SW480细胞调整细胞浓度接种于96孔板中，使其浓度为5×103个细胞/孔，24 h后按照药物5个浓度梯度，每孔加入不同浓度的奥沙利铂药物；20 h后每孔加入20 μL的MTT工作液继续培养4 h，上机前每孔加入100 μL孵育15 min，在490 nm波长下检测各孔的光密度（OD）值，细胞存活率=OD加药组/OD对照组×100%，根据公司计算药物对细胞的抑制效率。每组细胞设3个复孔，以上实验重复3次。

1.2.5 流式细胞技术检测靶细胞的凋亡率 于细胞转染24 h后，收集空白组、对照组和实验组细胞，以1×105个/mL的浓度将细胞接种于6孔板中，每孔接种1 mL，其中一半的空白组、对照组和实验组细胞加入药物奥沙利铂，使其培养基终浓度为5 μg·mL-1，设为空白给药组、对照给药组和实验给药组细胞，另一半为普通培养基。继续培养24 h后收集各组细胞，用冷PBS缓慢洗涤2遍，以1 000 r·min-1，离心5 min弃掉上清。加入凋亡试剂进行染色，避光放置10 min后，流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.2.6 CCK-8检测细胞增殖情况 按照RNA干扰操作说明书进行干扰片段的转染，4 h后更换常规培养基，24 h后收集空白组、对照组和实验组细胞，按照5×103个/mL的浓度将细胞接种到96孔板中，每孔接种0.1 mL，其中一半的空白组、对照组和实验组细胞加入药物奥沙利铂，使其培养基终浓度为5 μg·mL-1，设为空白给药组、对照给药组和实验给药组细胞，另一半加入普通培养基。继续培养24 h后更换普通培养基，分别加入CCK-8试剂，于24、48、72和96 h检测各组细胞在480 nm波长下的OD值，细胞抑制率=（1-细胞存活率）×100%，计算药物对细胞增殖的抑制情况并绘制曲线。

1.2.7 集落形成实验检测细胞存活分数 于细胞转染24 h后，收集空白组、对照组和实验组细胞，调整细胞浓度至1×103个/mL，将细胞接种到6孔板中，每孔接种2 mL。其中一半的空白组、对照组和实验组细胞加入药物奥沙利铂，使其培养基终浓度为5 μg·mL-1，设为空白给药组、对照给药组和实验给药组细胞，另一半为普通培养基。继续培养24 h后更换普通培养基，继续培养10 d后弃培养基，PBS洗涤2遍，甲醇固定后，加入0.1%考马斯亮蓝染液染色，1 h后流水冲洗并晾干。低倍镜下计数≥50个或直径>0.5 mm的细胞集落数。根据公式计数集落形成率（colony form-ing efficiency，CFE）。CFE=（集落数/接种细胞数）×100%。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0与GraphPad Prism 8软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，各组间比较采用单因素方差分析，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 polι基因干扰效果检测

采用Real time PCR检测基因的相对表达量，结果显示：与对照组及空白组相比，实验组polι表达水平降低39%（P均＜0.05）；对照组和空白组间的差异无统计学意义（P＞0.05），1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 μg·mL-1给药浓度的奥沙利铂的抑制率分别为3.8%、39.6%、52.2%、68.4%、94.8%，见图1。

图1 RT-qPCR检测polι基因在SW480细胞中的表达

2.2 奥沙利铂给药剂量的确定

MTT实验结果显示，药物浓度在5 μg·mL-1时的抑制率为52.2%，因此选择该浓度为给药浓度进行后续实验。

2.3 下调polι基因表达对细胞凋亡的影响

流式细胞术结果显示，未加药物处理时，空白组、对照组与实验组之间细胞凋亡率差异均无统计学意义（P均>0.05）；加入奥沙利铂后，实验加药组与对照加药组和空白加药组相比细胞凋亡率增高（P均<0.01），见图2。

图2 下调polι基因表达对细胞凋亡的影响

2.4 下调polι基因对细胞增殖的影响

CCK-8实验检测显示，与对照加药组相比，实验加药组和空白加药组细胞增殖率降低（P均<0.05）；空白加药组和对照加药组的细胞增殖率差异无统计学意义（P>0.05），见图3。

图3 下调polι基因对细胞增殖的影响

2.5 下调polι基因对细胞克隆形成的影响

集落实验检测目的基因对药物敏感性的影响。结果显示，空白组、对照组和实验组相比，集落形成数量差异无统计学意义（P>0.05）；与空白加药组和对照加药组相比，实验加药组的集落形成数量降低（P均<0.05），见图4。

图4 下调polι基因对细胞克隆形成的影响

3 讨论

目前铂类药物广泛应用于肿瘤的临床治疗，而在肿瘤的长期化疗与放疗过程中，有越来越多的患者对药物产生耐药性，最终导致治疗失败。研究显示[6]，DNA损伤修复是肿瘤细胞对铂类药物产生耐药的机制之一，也是奥沙利铂在结直肠癌细胞中的耐药机制。跨损伤DNA合成（translation DNA synthesis，TLS）是一种利用损伤核苷酸为模板，通过DNA聚合酶DNA进行自我修复的重要方式。有研究[7]发现，DNA聚合酶zeta和iota是肿瘤细胞对化疗药物耐受的关键。polι基因是参与TLS过程的重要DNA聚合酶，已被证实在人类食管癌、人神经胶质瘤、葡萄膜黑色素瘤和乳腺癌中高表达[4，8]，提示polι基因的异常表达与肿瘤的形成有关。Nicolay等[9-10]发现DNA聚合酶polβ能导致肿瘤细胞对铂类化疗药物耐药，并提出polβ突变与结肠癌发生有关，由此推测polι基因可能在结肠癌细胞对铂类药物耐药中起重要的作用。刘瑾等[11]研究中发现，下调食管癌细胞polι基因的表达，肿瘤细胞对顺铂的敏感性提高。本研究结果显示，下调polι基因的表达水平对结肠癌细胞SW480的增殖和凋亡水平没有显著影响，但会提高细胞对奥沙利铂的敏感性，表现为细胞凋亡数量增加、早期和晚期凋亡的数量明显上升。Li等[12]研究发现，干扰polι不会影响肺癌A549细胞的增殖和凋亡，但它可以抑制肺癌细胞的迁移和侵袭。Zhou等[13]对人类食管癌细胞中的polι基因分别进行沉默和过表达后给予顺铂处理，发现polι基因过表达后，食管癌细胞对顺铂耐受性提高，反之沉默polι基因表达后细胞对顺铂的敏感性会显著增加，同时polι基因的下调表达可抑制食管癌细胞的生长与克隆形成。本研究结果显示，低表达polι基因同时辅以奥沙利铂药物后，细胞的增殖被抑制，克隆形成率降低。

本次实验显示，单纯降低polι基因在结肠癌细胞中的表达，细胞的凋亡和增殖并未受到明显影响，但细胞对铂类药物的敏感性却提高。推测polι基因正常情况下可能并不是结肠癌细胞保证生存的必要基因，而当细胞受到外界因素刺激干扰后，polι基因开始变得重要，表现为细胞对铂类药物刺激的保护作用。提示polι基因可能是增加结肠癌细胞对铂类化放疗药物抵抗性的一个因素。在临床治疗中，通过抑制polι基因在结肠癌组织中的表达，可以提高结肠癌细胞化疗敏感性，从而提高结肠癌治疗的效果。

同时，作为DNA跨损伤合成途径的重要聚合酶，polι具有修复多种DNA损伤功能，可与其他跨损伤合成途径的聚合酶共同作用于DNA损伤位点，参与由UV引起的多种DNA损伤的修复，如（6-4）T-T光产物DNA损伤、T-T环丁院二聚物DNA损伤[14]，以及DNA双链断裂等。下一步，将以化放疗治疗中使用的射线为对象，探讨polι在射线造成的DNA损伤的作用，为临床治疗提供新的治疗思路。