张雅晴，刘礼新

（1.甘肃省妇幼保健院；2.兰州大学第一医院，甘肃 兰州 730000）

真核细胞转录形成的前体mRNA经过去除内含子，使外显子按照一定的顺序重新拼接在一起，形成成熟mRNA的过程称为剪接；而不同的外显子组合产生不同的成熟mRNA的过程称为可变剪接（alternative splicing，AS），也称为选择性剪接［1］。大约95%的人类蛋白编码基因通过AS产生多种mRNA亚型，增加了真核生物基因表型和蛋白质功能的多样性［2-3］。可变剪接的最终蛋白产物会表现出不同的结构或相互拮抗的功能，并且在相同的细胞类型中可能由于表达水平的差异而导致不同的表型。近几十年来，随着高通量测序技术的发展，人们发现肿瘤组织比正常组织多高达30%的AS事件［4］。肿瘤细胞中异常AS事件，产生特殊的剪接亚型，影响细胞功能，控制肿瘤发生、发展。深入了解AS机制可为开发靶向癌症治疗策略提供新的机会。

去除内含子、连接外显子、产生成熟mRNA的剪接过程是由剪接体完成的，剪接体是RNA和蛋白质组成的复合物，由U1、U2、U4、U5、U6小核糖核蛋白（small nuclear ribonucleoprotein，snRNP）和200多种蛋白质组成［5-6］。剪接的关键在于剪接体各组分通过识别mRNA上高度保守的一种GU-AG序列，即内含子5'端为GU，3'端为AG；这类内含子以同样的方式被剪接，然后两端的外显子进行拼接［7］。细胞内的可变剪接过程受到多种因素调控，如剪接位点的碱基序列、RNA的二级结构和剪接调控元件等［8］。剪接位点的识别和选择以及剪接体的聚集需要顺式作用元件和反式作用因子［9］。顺式作用元件，分为内含子剪接增强子（intronic splicing enhancer，ISE）和内含子沉默子（intronic splicing silencer，ISS），以及外显子增强子（exonic splicing enhancer，ESE）和外显子沉默子（exonic splicing enhancer silencer，ESS），是除可变外显子和内含子外唯一提供与反式作用因子结合的基因位点。在癌症中，AS事件已经多次被观察到，其原因是编码顺式作用元件［10］或剪接因子［11］或AS机制中相关基因的突变［1，12］影响剪接位点的识别。

异常AS事件与多种疾病相关，如阿尔茨海默病、先天性肌无力综合征、脊髓肌肉萎缩、系统性红斑狼疮、心血管疾病和糖尿病等。大多数疾病都是由于位于规范RNA剪接位点的基因突变或剪接体、剪接调节因子表达水平的改变造成的。除了这些，AS与恶性肿瘤也密切有关。

肿瘤发生是一个复杂的多步骤过程，涉及多个基因的异常表达。在癌细胞中，剪接因子的异常表达导致可变剪接事件的紊乱，导致蛋白表达异常，促进恶性进展。越来越多的证据证明了异常AS在肿瘤发生和发展中的重要作用。一项对33种不同癌症类型的癌症基因组图谱（TCGA）数据的分析表明，119个剪接因子基因的突变可能是癌症的驱动因素［13］。除了基因突变，在癌症中，超过70%的剪接因子和84%的RNA结合蛋白在mRNA水平上调控异常［14-15］。通过突变或改变对剪接机制和调节因子的干扰导致癌基因和抑癌基因的异常AS，形成特异性异构体，促进肿瘤发生、发展。与正常细胞不同，在癌症细胞中，由于剪接过程干扰和无效的无意义介导的mRNA衰减（nonsense mediated mRNA decay，NMD），大量异常转录本积累。NMD是mRNA质量控制系统的一部分，它负责异常转录本的降解。在癌细胞中，NMD调节也经常被破坏，导致异常转录本的积累［16-17］。2013年有学者提出，异常剪接是癌症的新标志［18］。异常选择性剪接的发生能够促进肿瘤细胞增殖转移、血管新生、免疫逃逸等恶性行为。

1 AS与增殖、凋亡

异常AS能够通过产生具有异常增殖特性或抗凋亡特性的剪接异构体参与癌基因激活。细胞周期中不同步骤的调节改变会导致癌细胞的无序增殖。许多参与细胞周期调控的基因表现出剪接变异。例如，基因CCND1编码细胞周期蛋白D1有两个剪接异构体：细胞周期蛋白D1a和细胞周期蛋白D1b［19］。Cyclin D1b的形成与基因外显子4和内含子4连接的G/A多态性直接相关［20］。Cyclin D1a可与CDK4/6相互作用形成复合物，并负责肿瘤抑制蛋白Rb的磷酸化，从而促进细胞增殖。Cyclin D1b也能与CDK4相互作用，但不能磷酸化Rb［21-22］。细胞周期蛋白D1b和细胞周期蛋白D1a之间可能存在着一种平衡，前者通过对抗细胞周期蛋白D1a的功能来限制癌症的生长［23］。

RNA结合序列蛋白5（RNA-binding motif protein 5，RBM5）作为肿瘤抑制基因和剪接因子，通过识别表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）前体mRNA错误的3'剪接位点，提高无意义mRNA的产生，从而抑制肿瘤细胞的增殖［24］。整合素α6（integrin subunit alpha 6，ITGA6）前体mRNA可变剪接成两个剪接亚型：TGA6A和ITGA6B。在结肠癌细胞中，原癌基因MYC可以通过上皮剪接调节蛋白2（epithelial splicing regulatory protein 2，ESRP2）调节ITGA6整合素基因的启动子激活和剪接，从而有利于结直肠癌细胞中促增殖性ITGA6A异构体的产生，促进细胞增殖［25］。在肺癌细胞中发现了RNA结合序列蛋白10（RNA-binding motif protein 10，RBM10）的突变，影响NUMB剪接调控，并诱导肿瘤的增殖［26］。

凋亡是生物体内重要的生理过程，机体通过凋亡清除衰老及异常细胞。肿瘤细胞则表现出凋亡被抑制的特性。可变剪接是凋亡过程中重要的调控形式，同一基因转录的mRNA前体通过不同的剪接产生不同转录本，翻译得到不同的蛋白异构体。例如：Bcl-x可以获得两种不同的剪接亚型，Bcl-xl和Bcl-xs，其中Bcl-xl抑制凋亡，Bcl-xs促进凋亡［27］。有报道称多聚嘧啶区结合蛋白1（polypyrimidine tract-binding protein 1，PTBP1）过表达可产生促进细胞凋亡的Bcl-xs；相反，下调PTBP1可产生Bcl-xl，抑制细胞凋亡［28］。诱导的MCL-1作为Bcl-2家族调控因子中的凋亡因子，当其表达降低时可引起细胞凋亡，而MCL-1基因的选择性剪接可由剪接因子SRSF5和SRSF1调控［29］。

Caspase是在细胞凋亡过程中发挥重要作用的蛋白质。其中一种caspase-3是一种促凋亡蛋白，在细胞凋亡过程中通过裂解被激活［30］。它具有一个催化结构域，使其在细胞凋亡过程中发挥作用。caspase-3的AS产生了另一种亚型caspase-3s［31］。这种异构体在癌症组织中的表达明显高于在健康组织，并且无催化位点，这种亚型抑制细胞凋亡。

抗凋亡因子如survivin也会发生AS。在生理背景下，该蛋白弱表达，但在大多数人类癌症中已观察到其过表达。最近通过高通量测序获得的数据发现了14种新的异构体［32］。其中survivin-ΔEx3通过与caspase-3和Bcl-2结合，阻断其裂解，保持抗凋亡功能［33］。Survivin-3B，它在肿瘤中特异性表达，具有抗凋亡的特性，它能结合caspase-8和caspase-6促进免疫逃逸和化疗耐药［34-35］，靶向survivin-3B，可能对癌症治疗有用。另外两个异构体，survivin-2B［36］和survivin-2α［37］被描述为促凋亡异构体。

综上可见，AS对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响可能为肿瘤治疗提供新的治疗靶点。

2 AS与侵袭、转移

侵袭和转移是肿瘤治疗的两大障碍。上皮-间充质转化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）在肿瘤转移和复发过程中被异常激活。转化生长因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）作为EMT的主要诱导因子，诱导转化生长因子-β激活激酶1（transforming growth factor-beta activated kinase 1，AK1）在EMT过程中选择性剪接以排斥外显子12［38］。CD44是细胞膜上的一种糖蛋白，是肿瘤中被广泛认可的干细胞标志物。在EMT中，CD44的选择性剪接是通过剪接因子ESRP1的调控而改变的，它决定了CD44与细胞表面受体酪氨酸激酶之间的相互作用，所生成的CD44s可促进乳腺癌细胞EMT的发生和发展［39］。ESRP1和hnRNPM可以竞争前体mRNA中富含GU的结合位点，并调节外显子包含或跳跃，促进细胞上皮-间充质转化［40］。最近研究发现，hnRNPM和ESRP1是EMT剪接程序的关键调控因子，并且与乳腺癌相关［41］。

RAC1的活性剪接异构体，包括外显子4，被称为RAC1b，在多种肿瘤类型中过表达。Rac1b在乳腺癌小鼠模型中被确定为Srsf1的直接剪接靶点，已被证明通过产生活性氧（ROS）介导EMT。Rac1b过表达后，ROS增加诱导EMT转录因子Snail，上调vimentin，从而导致EMT的诱导，促进肿瘤的发展［42］。

3 AS与血管生成

新生血管形成是肿瘤进展的关键特征之一。许多蛋白质作为血管生成激活因子，包括成纤维细胞生长因子、肿瘤坏死因子-α和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）。VEGF-A由8个外显子组成，由6、7、8号外显子交替选择3'和5'产生不同亚型，控制血管生成。VEGF-A可以促进血管生成和抗血管生成，被用于抗血管生成治疗［43］。据报道，抑制丝氨酸/精氨酸蛋白激酶1（Serine/arginine protein kinase1，SRPK1）可 以 将VEGF的剪接转化为VEGF120，具有抗血管生成作用，从而抑制肿瘤内皮细胞的生长［44］。来自小鼠视网膜模型的证据表明，SRPK抑制剂1（SRPKIN-1）作为SRPK的抑制剂，可以调节VEGF的剪接，然后将其转化为抗血管生成的VEGF-A165b亚型［45］。血管生成中其他因子的选择性剪接，以提供肿瘤发育所需的所有营养，需要进一步论证。

4 AS与能量代谢

越来越多的证据表明，与癌症相关的AS有助于促进肿瘤生长和增殖，部分原因是影响肿瘤代谢重编。在肿瘤发展过程中，由于过度生长，癌细胞可能会经历营养剥夺和缺氧。与正常细胞相比，肿瘤细胞更倾向于通过有氧糖酵解途径代谢葡萄糖，这使得一些基因编码酶易受选择性剪接的影响。糖酵解最后一步是磷酸烯醇丙酮酸转化为丙酮酸，该过程由PKM催化，PKM由两个基因编码：PKLR和PKM，每个基因产生两种不同的变体［46-47］。PKLR主要在肝脏和造血细胞中表达，但大多数组织表达PKM，编码PKM1和PKM2异构体［48］。通过两个互斥的外显子（外显子9和10）的选择性剪接，PKM1在正常细胞中结构性表达，而PKM2在肿瘤细胞中以细胞信号依赖的方式表达［49］。一项研究表明，PKM的选择性剪接受剪接因子的调控，如hnRNPA1/hnRNPA2，PTB/nPTB和SRSF3［50］，提示剪接因子在肿瘤代谢的选择性剪接中起重要作用。PKM2的上调在肿瘤中是常见的，有助于切换到糖酵解代谢，反映了PKM1和PKM2比率的调节，通过选择性剪接来决定有氧糖酵解和线粒体氧化磷酸化之间的选择，以响应代谢应激。肿瘤代谢受可变剪接事件影响的另一个方面是细胞对缺氧的反应，这是许多实体肿瘤内部体积的共同特征。最近的一项RNA-seq研究表明，乳腺癌细胞在缺氧条件下培养时发生了广泛的可变剪接变化，如主要内含子保留事件（LDHA、TNFSF13和ARHGAP4）以及外显子跳变（MARCH7、PCBP2和LRCH3）［51］。

脂肪酸代谢的改变也被认为是肿瘤进展过程中另一个重要的代谢异常。脂肪酸在能量储存、膜合成和信号分子产生等方面发挥着重要作用［52］。脂肪酸必须转化为酰基辅酶A（long-chain acyl-CoA synthetase，ACSL），酰基辅酶A合成酶催化脂肪酸的转化［53］。ACSL家族包括五个异构体，每个都由一个不同的基因编码，并有几个剪接变体［54］。其中ACSL4在肝脏肿瘤细胞中的表达明显高于正常组织，其通过破坏脂质代谢途径参与肿瘤的发生。ACSL4的表达在乳腺癌细胞中也被观察到促进肿瘤生长。

5 AS与化学、靶向耐药

肿瘤发生的一个重要基础是基因表达谱的重新编程，这导致产生有利于肿瘤细胞生长和增殖的蛋白质［55］。这些蛋白在正常细胞和肿瘤细胞之间有差异表达，可以作为抗癌药物的特异性靶点，在消除肿瘤细胞的同时降低其对正常细胞的细胞毒性。然而，肿瘤细胞不可避免的耐药性极大地限制了靶向药物的临床应用。异常可变剪接是改变肿瘤细胞基因表达谱的主要因素，它通过改变靶向药物的靶点和信号转导途径诱导肿瘤细胞产生耐药性。伊马替尼是一种抑制酪氨酸激酶的抗肿瘤药物，常用于治疗慢性骨髓性白血病，通过与BCL2家族成员BIM的BH3结构域结合，诱导其失活，从而促进白血病细胞的凋亡［56］。然而，BIM-γ，一个跳过外显子4的剪接异构体，参与了白血病细胞对伊马替尼的耐药性［57］。BIM可能由于缺乏exon4而缺乏伊马替尼的靶标，从而进一步诱发了对伊马替尼的耐药性。雌激素受体（ER）在雌激素刺激下诱导靶基因的转录，是乳腺癌发生的主要因素。因此，针对雌激素受体的抗癌药物他莫昔芬通过改变雌激素受体的构象和扰乱乳腺癌靶基因的转录来抑制癌细胞的增殖［58］。然而，一些乳腺癌患者对他莫昔芬产生了耐药性。ER家族主要包括两类成员：ERα和ERβ。激素主要通过激活ERα来刺激细胞增殖。ERα有三种形式异构体，全长异构体ERα66和两个截断异构体ERα36和ERα46。ERα36转录本跳过外显子7和外显子8缺乏转录激活域，因此不能直接激活靶基因转录［59］。然而，研究表明，ERα36可以激活备用通路调节肿瘤细胞的增殖，包括MAPK/ERK和PI3K/ATK通路［60］。目前ERα36已经被发现与他莫昔芬耐药密切相关。

许多乳腺癌和卵巢癌都存在BRCA1和BRCA2基因突变。这些蛋白是高效同源重组（HR）介导的双链DNA断裂修复所必需的。聚二磷酸腺苷核糖多聚酶（poly-ADP-ribose polymerase，PARP）参与单链DNA损伤的修复，从而减少了基因组中产生双链断裂的机会。因此，通过PARP抑制剂（PARPi）阻断PARP酶对BRCA1/2基因失能的患者非常有效［61］。尽管PARP抑制剂已被证明可以提高生存期，但许多携带种系BRCA1或BRCA2突变的患者并不能从PARPi治疗中获益。此外，许多首次受益于PARPi或铂治疗的患者出现疾病进展和耐药［62］。植入BRCA1外显子11突变肿瘤的小鼠表达了高水平的BRAC1-Δ11q，对PARPi抑制剂和顺铂耐药［63］。抑制剪接体降低了BRAC1-Δ11q水平，并使外显子11突变细胞系对PARPi增敏，这可能为表达高水平BRAC1-Δ11q的肿瘤重新增敏提供了一种策略。有趣的是BRAC1-Δ11q水平可以通过剪接体抑制剂或ASOs来降低，从而使细胞对PARP1抑制剂敏感［63-64］。

6 AS与免疫逃逸及免疫治疗耐药

肿瘤免疫治疗是未来肿瘤治疗策略的中心支柱，其中宿主免疫系统利用免疫检查点抑制剂或过继免疫细胞来消除肿瘤细胞。尽管与传统治疗方案相比，免疫疗法有一些优势，但它在临床环境中还未得到普及。这与某些肿瘤的高耐药性有关，同一肿瘤实体的不同区域对免疫治疗的反应频率不同。据报道，可变剪接通过调节相关基因的表达参与了肿瘤-免疫相互作用，即一些异常的选择性剪接事件有助于肿瘤细胞免疫逃逸［65］。具体地说，肿瘤细胞可以通过异常的选择性剪接分泌具有异常结构的蛋白，作为诱饵结合免疫检查点抑制剂。同时异常的选择性剪接事件介导了肿瘤细胞表面抗原的丢失，导致一些适应性免疫细胞无法识别肿瘤细胞。

在肿瘤中，PD-1主要表达于免疫细胞表面，而PD-L1则表达于多种肿瘤细胞上。抗PD-1/PD-L1抗体（aPD-1/aPD-L1）可以与PD-1或PD-L1结合，从而阻止T细胞表面PD-1和肿瘤细胞PD-L1的相互作用，进而部分恢复T细胞功能，从而增强T细胞杀死肿瘤细胞的作用，已经被有效地用于治疗多种癌症。然而，一些肿瘤类型，如肺癌和胰腺癌，对这些抗体的反应较差。最近，在多种癌症中发现了一种癌源性PD-L1剪接异构体，它可以从细胞中分离出来，在肿瘤微环境中积累，从而不同于在肿瘤细胞表面观察到的野生型PD-L1表达［66］。值得注意的是，已经证明PD-L1接异构体与aPD-L1抗性有关。

CAR-T细胞是通过基因工程表达靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体的过继性T细胞，通常用于治疗血液系统恶性肿瘤。肿瘤细胞表面的CD19抗原是CAR-T细胞中最常用的靶点。CARTER-19通过表达抗CD19的嵌合抗原受体来治疗B细胞驱动的恶性肿瘤［67］。CARTER-19免疫治疗已经报道了显著的临床效果，它可能诱导针对肿瘤细胞的免疫效应。但部分患者对CART-19疗效较差，CART-19治疗后癌症复发的现象也不容忽视。有研究发现，肿瘤细胞表面抗原表位的丢失是抗CARTER-19的主要机制［68］。在B细胞淋巴瘤患者的耐药和复发样本中检测到CD19Δex2丰度增加和CD19全长转录本水平下降。表达CD19Δex2的恶性B细胞无法被CARTER-19识别，导致对CARTER-19产生耐药性。恶性B细胞中SRSF3的低表达诱导CD19Δex2的产生，这归因于SRSF3作为参与CD19外显子2保留的剪接因子［69］。

7 展望

异常的可变剪接改变了癌细胞中的蛋白质表达模式，导致产生功能异常的蛋白质异构体，从而增强治疗抗性，是近年来癌症研究的热点。然而，异常AS通过改变药物作用的靶点和药物信号通路，已成为靶向治疗和免疫治疗临床应用的主要障碍。幸运的是，目前靶向可变剪接的药物也在研发中，如小分子抑制剂与反义寡核苷酸（Antisense oligonucleotides，ASOs）。其中，ASOs是最有前途的治疗药物，其序列可以被设计成靶向癌细胞中的特定剪接事件，从而抑制肿瘤友好蛋白亚型的产生，并降低对靶向治疗和免疫治疗的耐药性。因此，根据肿瘤异质性产生不同序列的ASOs是未来肿瘤治疗可行的研究方向。将这种特殊的ASOs与免疫治疗药物和靶向治疗药物相结合，可以最大限度地限制耐药性的产生，同时为癌症患者提供个体化、精准的治疗方案，达到预期的治疗效果。因此，对可变剪接调控机制的深入研究拓展了我们对肿瘤发生的认识，为肿瘤治疗提供新的方向。