吴 梅， 李树全， 李小娇， 赵典远， 郑永仁

(1.云南中医药大学 中药学院/云南省南药可持续利用研究重点实验室， 云南 昆明 650500； 2.云南省高校外用给药系统与制剂技术研究重点实验室， 云南 昆明 650500； 3.云南中医药大学 科研实验中心， 云南 昆明 650500)

0 引言

【研究意义】余甘子又名滇橄榄，来源于大戟科(Euphorbiaceae)叶下珠属植物余甘子(PhyllanthusemblicaL.)的果实，具有清热凉血、消食健胃、生津止咳之功效[1]。余甘子是印度传统医药阿育吠陀中最常用的药浆“三果浆”的原料之一，使用频率极高，在我国藏医药中亦占有十分重要地位，作为藏族习用药材收录于《中国药典》，此外亦应用于傣族、彝族等10余个少数民族医药，但在中医方剂中较少应用，李时珍在《本草纲目》中将其移入果部，多做果品食用[2-3]。余甘子鲜果味酸涩，且极难贮存，冷藏可减缓变质，但也只能延长保鲜6～9 d；其常规干燥方法为晒干，干燥过程中颜色逐渐加深成棕褐色或墨绿色，随着果实褐变其化学成分也发生变化，如没食子酸的含量逐渐增加[4]。因此，研究余甘子的干燥加工方法对其功能性食品的开发具有重要意义。【前人研究进展】自由基对生命过程起着重要的调控作用，过量自由基会引起生物膜及DNA的氧化性损伤，与癌症、动脉硬化等疾病以及衰老密切相关，抗氧化物质可通过切断过氧化链式反应而抑制自由基损伤，维生素C及植物多酚是膳食中重要的抗氧化物质，广泛存在于水果、蔬菜及谷物中[5-7]。余甘子是一种营养价值较高的果品，富含维生素C等维生素、有机酸、蛋白质、粗纤维以及镁钾等矿物质，含有丰富的植物多酚，同时余甘子具有较强的清除自由基、抗氧化活性[8-11]。加工方法及贮藏条件均影响余甘子中维生素C、植物多酚的含量，如张福平等[12-13]研究表明，鲜果若不及时干燥，维生素C的含量损失接近70%，低温贮藏有利于余甘子营养物质的保存；徐涓等[14]用高温蒸汽处理余甘子果汁，可减轻因酶促导致的褐变，减轻维生素C的氧化分解以及多酚类物质的氧化聚合。【研究切入点】余甘子干燥方法除直接晒干外，民间亦采用蒸后晒干、冷冻贮藏后再解冻晒干以及去皮后晒干，能减轻果实褐变，但不同干燥方法对余甘子中维生素C、植物多酚含量及抗氧化作用的影响尚不明确。【拟解决的关键问题】通过测定不同干燥方法加工的余甘子中维生素C、植物多酚含量以及对酪氨酸酶活性的抑制作用，以期建立余甘子科学、合理的干燥加工方法，为余甘子在功能性食品方面的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 余甘子 余甘子采自云南省普洱市景谷，经鉴定为大戟科植物余甘子(P.emblicaL.)的果实。鲜品去核后，采用以下干燥加工方法：直接晒干，记作PE-晒干；去皮后晒干，记作PE-去皮；冷冻24 h后解冻再晒干，记作PE-冻后；烘干(50℃)，记作PE-烘干；真空冷冻干燥，记作PE-冻干；蒸2 min、8 min或32 min后晒干，分别记作PE-蒸2、PE-蒸8、PE-蒸32。

1.1.2 试剂 没食子酸对照品(J&K, 纯度99%)、维生素C对照品(中国食品药品检定研究院，批号：1021H023，纯度100%)、曲酸对照品(J&K, 纯度99%)、酪氨酸酶(上海源叶，1 240 U/mg)、左旋多巴(Adamas-beta，纯度99%)、福林酚试剂乙(上海蓝季生物)、甲醇(Fisher，色谱级)，其他试剂均为分析纯，试验用水为娃哈哈纯净水。

1.1.3 仪器 真空冷冻干燥机(新芝SCIENTZ-30F)、高效液相色谱仪(Waters e2695，配2489UV-Vis 检测器)、紫外分光光度计(岛津UV-2450)、多功能酶标仪(TECAN Spark 10 M)、水浴锅(Leica HI1210)、电子分析天平(岛津AUW220D)、超声波清洗器(昆山禾创KH7200B，400 W，40 kHz)。

1.2 方法

1.2.1 余甘子总多酚含量测定 采用福林酚比色法测定总多酚含量[15]。

1) 系列标准溶液的制备。参考《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》(GB/T 8313—2008)，取适量没食子酸对照品，精密称定，加50%甲醇溶解，配制成浓度分别为5.28 mg/L、10.56 mg/L、21.12 mg/L、31.68 mg/L、42.24 mg/L、52.80 mg/L的系列标准溶液。

2) 供试品溶液的制备。精密称定供试品粉末50 mg，置具塞锥形瓶中，精密加入50 mL 50%甲醇，称定重量，水浴回流1 h，放冷，用50%甲醇补足质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

3) 测定方法。分别精密吸取系列标准溶液与供试品溶液各1 mL至具塞试管中，加10%福林酚试剂5 mL摇匀，静置5 min后，再加入7.5%碳酸钠溶液4 mL摇匀，室温下避光静置1 h后，在波长765 nm处测定吸光度，按干燥品计算总多酚含量。

1.2.2 余甘子维生素C含量测定 参照文献[16]的方法适当调整。

1) 色谱条件。采用Inertsil ODS-SP色谱柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)；以甲醇-0.15 mmol/L磷酸二氢钾溶液(5∶95)为流动相；检测波长为243 nm；流速0.4 mL/min；柱温30℃。

2) 对照品溶液的制备。精密称取维生素C对照品，用6% 醋酸(冷新沸水配制)溶解，制成每1 mL中含有维生素C 80 μg，临用前配制。

3) 供试品溶液的制备。精密称定供试品粉末0.1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入6% 醋酸50 mL，称定重量，超声处理20 min(控制温度<10℃)，用6%醋酸补足质量，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

4) 测定方法。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5～10 μL，注入液相色谱仪，测定，按干燥品计算维生素C的含量。

1.2.3 余甘子抗氧化活性测定 采用酪氨酸酶活性抑制试验评价抗氧化活性[17]。

1) 对照品溶液的制备。精密称取曲酸对照品，用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH 6.8)溶解，逐级稀释成1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.04 mg/mL、0.008 mg/mL系列浓度，临用前配制，用于试验有效性验证。

2) 供试品溶液的制备。精密称定供试品粉末1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入50 mL水，称定重量，超声处理20 min(控制温度<10℃)，用水补足质量，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，再逐级稀释，制成20 mg/mL、10 mg/mL、5 mg/mL、2.5 mg/mL系列浓度。

3) 测定方法。精密吸取样品溶液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH 6.8)及酪氨酸酶溶液(100 U/mL)充分混匀(表1)，置37℃水浴孵育10 min，再加入左旋多巴溶液(1 mg/mL)，反应5 min，在475 nm处测定吸光度。

表1 酪氨酸酶活性测定反应液配比

酪氨酸酶活性抑制率=[1-(T-T0)/(C-C0)]×100%

1.3 数据分析

采用单因素方差分析(ANOVA)及Tukey多重比较分析数据间显著性差异；Probit回归分析估计酪氨酸酶活性抑制作用的IC50(95%置信限)；相关性分析采用 Spearman检验，检验水准P<0.05。以上数据均使用SPSS 17.0进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 余甘子总多酚的含量

由图1可见，建立没食子酸标准曲线，线性回归方程为y= 0.008 4x+ 0.056 3(R2=0.999 2)，没食子酸为5.28～52.80 mg/L，线性关系良好。

由表2可见，不同干燥方法加工的余甘子中总多酚含量均较高，其中，真空冷冻干燥的余甘子中总多酚含量最高，达37.39 mg/g，冷冻24 h后解冻再晒干的余甘子总多酚含量最低，仅23.78 mg/g，与其他干燥方式有显著性差异；直接晒干、去皮晒干、蒸后晒干及烘干等方法间无显著性差异，总多酚含量为28.60～30.74 mg/g(F7,16=73.21，P<0.05)。

图 1 没食子酸的标准曲线

表2 不同干燥方法处理余甘子总多酚、维生素C含量及酪氨酸酶的活性

2.2 余甘子维生素C的含量

2.2.1 方法学考察

1) 系统适应性试验。经测定，色谱峰分离度良好(R>1.5)，理论塔板数大于3 000，符合含量测定要求(图2)。

注：A,阴性对照；B,维生素C对照品；C,供试品。

2) 线性关系。经测定，以峰面积为纵坐标(y)、进样量(μg)为横坐标(x)，线性回归方程为y= 8×106x+ 52 897(R2=0.999 6)，维生素C为0.025～1.242 μg，线性关系良好。

3) 精密度试验。相对标准偏差(RSD)为0.42%(n=6)，表明仪器精密度良好。

4) 稳定性试验。RSD为2.97%(n=6)，表明样品溶液在室温下放置7 h内稳定。

5) 重复性试验。RSD为2.07%(n=6)，表明该方法重复性好。

6) 加样回收率试验。平均加样回收率为94.8%，RSD为2.61%(n=9)，表明该方法准确可靠。

2.2.2 维生素C含量 由表2可见，不同干燥方法对余甘子中维生素C的含量有显著性影响(F7,16=394.57，P<0.05)，其中，真空冷冻干燥的维生素C含量最高，达20.44 mg/g；直接晒干的为17.33 mg/g，去皮晒干、烘干与其无显著性差异；冷冻24 h后解冻再晒干的维生素C含量仅14.75 mg/g，与上述干燥方法有显著性差异；蒸后晒干的维生素C含量显著下降，为10.51～10.78 mg/g，蒸2 min、8 min、32 min后晒干间无显著性差异。

2.3 余甘子的抗氧化活性

2.3.1 有效性验证 阳性对照曲酸抑制酪氨酸酶活性的IC50为0.076 mg/mL，在有效范围0.05～0.15 mg/mL内，表明该试验体系有效。

2.3.2 酪氨酸酶活性 由表2可见，不同方法干燥余甘子均具有抑制酪氨酸酶活性的作用，其中，直接晒干和真空冷冻干燥的余甘子抑制作用的IC50分别为9.8 mg/mL和10.3 mg/mL，而蒸2 min后晒干、蒸8 min后晒干、蒸32 min后晒干、冷冻24 h后解冻再晒干的IC50>12 mg/mL。抑制作用为直接晒干>真空冷冻干燥>去皮后晒干>50℃烘干>蒸32 min后晒干>蒸2 min后晒干>冷冻24 h后解冻再晒干>蒸8 min后晒干。

2.4 余甘子中维生素C、总多酚及酪氨酸酶活性抑制作用间的相关性

经相关性分析，余甘子中维生素C含量与总多酚含量间无显著相关性(r=0.567，P>0.05)；余甘子中维生素C含量与酪氨酸酶活性抑制作用间呈正相关性(r=0.816，P<0.05)；余甘子中总多酚含量与酪氨酸酶活性抑制作用间无显著相关性(r=0.570，P>0.05)。

3 讨论

余甘子可用干品或鲜食，但鲜果与干果的化学成分有显著差异，主要是鞣质类成分，其干燥过程、贮藏过程及含量测定的提取环节等导致大分子鞣质水解或缩合，如诃黎勒酸水解产生柯里拉京和诃子次酸，而柯里拉京又可继续水解生成没食子酸和鞣花酸，干果(不包括真空冷冻干燥)中没食子酸、鞣花酸等小分子鞣质的含量远高于鲜果[18-20]。余甘子主要有效成分为没食子酸、鞣花酸及柯里拉京[21-22]。因此，本研究中虽然真空冷冻干燥的余甘子中维生素C及总多酚的含量均最高(与鲜果成分相近)，但抑制酪氨酸酶活性作用却略弱于直接晒干的余甘子。毛正睿[23]研究表明，热风烘干、自然风干与真空冷冻干燥的余甘子均具有较强的羟基自由基清除作用；热风烘干、自然风干对a-淀粉酶活性的抑制作用明显强于真空冷冻干燥。余甘子具有清热利咽、调节口腔微生态、促肠蠕动缓解便秘及抗氧化延缓衰老等作用[24-27]，在功能性食品领域有广阔市场，在开发不同保健功能时使用干鲜果应有所选择。

余甘子果核中主要含有脂肪酸类成分，鞣质含量远低于果肉，且抗氧化作用远不及果肉[28]。故本试验均采用去核后再干燥的加工方式，一定程度提高了干燥效率。直接晒干是最常用的干燥方法，简便经济，但果实表面颜色较深；去皮后再晒干的余甘子表面产生1层白霜，干后颜色较浅且涩味减弱；烘干(50℃)的干燥效率较高，口感上有较强胶质感。上述3种方法加工的余甘子在维生素C及总多酚含量上均无显著性差异。本试验中冷冻24 h后解冻再晒干的余甘子颜色较浅，但在维生素C及总多酚含量上均有显著降低，不适合作为余甘子的干燥方法；蒸会导致余甘子中维生素C的含量显著降低，虽然余甘子所含丰富的有机酸及多酚类成分有利于维生素C的稳定，直接晒干、去皮晒干及烘干(50℃)的余甘子中维生素C较真空冷冻干燥约降低15%，但仍对高温敏感。不同干燥方式对余甘子化学成分及功效的影响还有待进一步深入研究。

4 结论

真空冷冻干燥、直接晒干、去皮后晒干及烘干(50℃)的余甘子中均含有丰富的维生素C及总多酚，其中，真空冷冻干燥的含量最高；以对酪氨酸酶活性抑制作用的强弱为评价指标，直接晒干及真空冷冻干燥是余甘子最佳的干燥方法，维生素C含量与抑制作用的强弱正相关。