崔朋

黄山学院分析测试中心 安徽黄山 245041

近年来，综合化学实验的教学模式引起诸多学校的关注，综合实验把多学科的知识与技能综合交叉起来，有效地将各学科的实验操作及数据分析融合为一体，接受实验训练的学生可在一次实验中充分锻炼提升综合实验操作能力。同常规的专业实验对比，综合化学实验更加注重的是学生对基本知识的掌握和实验技能的训练操作，以及对实验数据的解析。同时重点培养学生在实验过程中分析问题和解决问题以及运用已掌握的知识归纳分析和总结实验的能力[1]。所以综合化学实验的开展内容囊括经典化学实验操作的同时，还应该根据地域及关注热点的变化及时调整更新，本实验介绍一个取材于黄山当地以红茶为原料开展综合化学实验——红茶发酵过程中茶黄素的提取与鉴定分析。

茶黄色素由Roberts发现，最初单指红茶中溶于有机相中呈橙黄色的物质，该类物质由多酚类及其衍生物在酶等物质的作用下氧化缩合而来，红茶中茶黄素类的含量一般为1%左右，对红茶的色、香、味及品质起着重要的作用。近年来，由于茶黄色素具有多种与人体健康有益的潜在功能，如抗自由基氧化、心血管疾病的防治、降血压血脂等，因而受到国内外的广泛关注，成为茶叶品质化学与功能成分的研究热点。因此，茶黄素的研究受到国内外的广泛关注[2-3]，使红茶的品质化学与功能成分研究成为热点[4]。本实验依据国标推荐方法中的溶剂体系和提取方法对红茶中的茶黄素进行提取，提取液经处理完成后，采用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱，结合UNIFI数据处理筛查软件对提取液中的茶黄素进行分离鉴定分析。

1 实验目的

熟悉天然产物提取的流程和方法；了解高分辨质谱的进样要求、基本原理和一般操作流程；掌握天然产物分离分析的步骤和鉴定方法。

2 实验原理

2.1 茶黄素的提取

茶黄色素以多酚类物质和儿茶素类物质为主要成分，还含有氨基酸、黄酮及黄酮醇等。茶黄素是茶色素的主要成分，目前资料显示有12种组分，其中茶黄色素以多酚类物质、儿茶素为主要成分，还含有氨基酸、维生索C、维生素E、维生素A原、黄酮及黄酮醇等。这些主要成分的12种组分，其中茶黄素(Cas：4670-05-7)，茶黄素-3-没食子酸酯(Cas：28543-07-9)、茶黄素-3，3’-双没食子酸酯(Cas：30462-35-2)和茶黄素-3’-没食子酸酯(Cas：33377-72-9)是四种最主要的茶黄素。本实验即围绕上述四种茶黄素物质的提取及检测开展实验。因茶黄素均为多羟基化合物，固本体系参照国标同样采用无水乙醇和水对红茶中的茶黄素化合物进行提取，具体提取操作如下所述。称取0.2g左右的红茶样品，将其粉碎后研磨均匀，倒进10mL的玻璃刻度试管中，加入预热过的无水乙醇溶液3.5mL，再加入水1.5mL，用玻璃棒充分搅拌均匀湿润，转移到水浴锅中，将水浴锅温度加热至70℃，浸提10min(隔5min搅拌一次)，浸提后冷却至室温，将上清液转移至50mL容量瓶中。残渣再用3.5mL的70℃无水乙醇溶液和1.5mL水提取一次，合并提取液定容至50mL容量瓶中，摇匀，过0.25μm膜待测。

2.2 茶黄素的快速筛查检测

高分辨飞行时间(HR-Tof)质谱系统为在构建包括蛋白质组学、代谢组学、天然活性成分、中药、药物代谢、糖肽等物质的研究中起着非常重要的作用，作为高端技术平台，该系统具有高分辨的定性筛查功能和高灵敏度的准确定量功能，辅以UNIFI数据筛查软件和自行建立的筛查平台，可实现目标物准确有效、快速筛查。

在本实验中，我们使用UNIFI软件包(UNIFI科学信息系统，Waters Corp.，MA)建立了一个信息学数据库。该软件包融合了超高效液相色谱和飞行时间质谱的操作、质谱数据采集、可视化的数据分析和使用先前建立的信息中获得的数据进行处理。该实验建立数据库包含用于在UNIF中自动识别儿茶素的关键检测参数，其中包括每种化合物的理论质荷比和碎片离子。实验前先明确设置上述参数，就可以使用UNIFI数据库对四种目标茶黄素进行快速筛选和鉴定。

本实验的流动相体系采用0.1%的甲酸水溶液和甲醇对提取样品进行洗脱，经优化后的质谱条件可获得信号较好的总离子流图及紫外信号图，如图1所示，二者具有良好的对应，信号最强的为咖啡因信号，前端的信号主要为儿茶素类化合物，因其极性较大，色谱柱对该类化合物的保留能力相对较弱，故出峰较为靠前。在质谱总离子流及紫外检测器的信号谱图中的14.6～15.4min中，紫外图谱中的四个检出信号(图1右上所示)即为四种茶黄素类化合物，检出目标物的出峰顺序与国标(GB/T 30483-2013)推荐图谱的信息一致。

以国标推荐的方法为参考对红茶的提取液进行测试，质谱信号明显清晰，随后将采集的数据导入UNIFI数据库中进行筛查，筛查出的一种茶黄素类物质如图2所示。采用上述提取及检测处理方式可获得目标化合物的检测信号，其准分子离子峰、碎片及碎裂方式均可直观地显示在一张图中。

图2 基于UNIFI筛查数据库筛查出的3，3'-二没食子酸酯茶黄素Fig2 The Theaflavin-3，3-digallate(TF3)screened based on UNIFI database

采用上述方法对红茶提取液进行检测，成功鉴定出了四种茶黄素(因篇幅有限及筛查原理一致，本实验报告只展示了图2一种，本实验的检出结果与文献资料报道一致)。由于茶黄素-3-没食子酸酯存在异构体，无精准保留时间筛查系统无法精准识别二者，因采用的色谱柱类型和洗脱流动相体系与国标大致相同，目标物的出峰顺序应与国标一致，最终确定筛查出的四种茶黄素依次是茶黄素、茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3′-没食子酸酯和3，3’-二没食子酸酯茶黄素。高分辨质谱系统作为一种高效精准的方法，在本实验中实现了四种茶黄素的快速鉴定识别。同理，高分辨质谱结合UNIFI筛查软件建立数据库之后也可用于其他目标物的快速筛查鉴定。

3 仪器与试剂

仪器：可控温水浴槽，分析天平，超高效液相串联四极杆飞行时间质谱系统配备UNIFI筛查软件。

试剂：乙醇，水，甲醇，甲酸。

4 实验步骤

4.1 红茶中茶黄素的提取

本文参照国标GB/T 30483-2013中茶黄素的提取方法，称取0.1g均匀碾磨后的茶叶样品于10mL玻璃离心管中，加入预热的甲醇水溶液5mL，震荡后转移至恒温热水浴中静置浸提10min，随后冷却至室温后采用离心机离心3min，取上清液移至10mL容量瓶中。残渣采用上述条件重复操作一次，合并提取液并定容至刻度，为防止氧化，提取液震荡摇匀后尽快取样稀释做测试。

4.2 提取液的质谱测试

洗脱体系实验采用甲醇及0.1%的甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，洗脱从10%甲醇开始，流速为0.3mL/min。溶剂甲醇在13min内以线性梯度从10%增加到35%，在35%下保持4min，随后在13min内增加到70%，然后在70%下保持5min。在下一次进样之前，流动相在1min内重置为10%A，并保持4min以重新平衡系统，进样量1μL，色谱柱为HSS T3色谱柱，柱温40℃，紫外检测波长为278nm；四极杆飞行时间的测试采用全通过模式，采集模式为continuum模式，亮氨酸脑啡肽为实时校正液(m/z 556.2771)，毛细管电压3kV，锥孔电压40V，质荷比(M/Z)测试范围为50～1200，离子源温度120℃，干燥气温度450℃，干燥气流速800L/h，质谱数据采集模式为双通道模式，即MSE模式以利于UNIFI筛查使用。数据采集前用70%的甲醇水溶液为空白样品做测试，以排除系统残留及干扰信号。

4.3 茶黄素的鉴定

首先查阅相关资料及文献报道，采用Chemdraw画图软件精准绘制四种茶黄素化合物的结构式，并导入UNIFI软件建立筛查信息库。提取液经超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱在优化后的测试条件下测试完成后将数据导入至UNIFI数据筛查系统，设置允许误差±10mDa及信号最小峰面积等筛查参数进行筛查，筛查结果见图2的陈述。

5 注意事项

(1)注意提取液中乙醇和水的比例。

(2)提取过程中注意摇匀，保证目标物提取充分。

(3)提取液冷却后补充定容并放入冰箱，尽快测试，防止茶黄素的氧化后信号减弱。

6 思考题

(1)目前未知物的鉴定与筛查方式有哪些？

(2)查阅相关资料，总结高分辨质谱系统的功能与作用。

7 结论

本实验以黄山本地名茶祁门红茶为原料，采用国标推荐的方法对茶叶中的茶黄素进行提取，并采用高分辨飞行时间(HR-Tof)质谱系统，结合UNIFI筛查软件对红茶提取液中的目标物进行鉴定分析。本实验可以让学生通过简单的提取获得红茶发酵过程中的提取液，借助高分辨质谱系统鉴定提取液中的茶黄素物质，引导学生了解天然产物的提取鉴定一般流程，领略高分辨质谱系统的魅力，从而激发学生对未来的知识学习和科学研究探索的兴趣。