刘颖梅，雷亚茹，石 瑜，张 莉，李占魁

(1.西安医学院，陕西 西安 710000；2.西北妇女儿童医院新生儿科，陕西 西安 710061)

感染性疾病是儿童发病率较高的疾病。儿童作为特殊群体，各器官功能发育不完善，免疫功能低下，易受各种病原体侵袭，是医院感染高危人群，重症感染患儿易并发休克、脏器功能衰竭而威胁生命。因此，尽早明确病原菌感染、针对性给予抗感染治疗，对于减少患儿并发症、降低病死率及改善预后有重要意义。

儿童感染性疾病的临床病原学诊断受采样困难、检测方法复杂等各种因素影响。以败血症为例，目前诊断的金标准仍依赖于血培养，但其有耗时长、灵敏度低、阳性率低等特点，难以满足当今儿科感染性疾病的诊疗需求。同时，对于不明原因发热的患儿，更需要快速、精准的检测方法鉴定出病原体。此外，常规检测方法易受抗生素的影响而造成假阴性，即便存在感染也未必全部能分离出病原微生物[1]。宏基因组二代测序(metagenomic next-generation sequencing，mNGS)技术具有无需培养，可直接对临床样本核酸进行测序的特点，从而快速、精准地检测出病原体，避免了传统病原体检测方法的局限性[2]。目前该技术逐渐应用于临床各科室，尤其是对危重疑难感染性疾病的诊治[3-5]。现对宏基因组二代测序在感染性疾病中应用的研究进展进行综述，为儿童感染性疾病的临床精准诊治提供参考依据。

1宏基因组的简介

宏基因组学亦称为“元基因组”，它是一种诞生于21世纪初期的新兴微生物检测技术，其定义是“微生物群落中所有基因组的集合”[6]。宏基因组学研究较传统的微生物研究而言，其最大的特点在于将微生物看成一个整体，直接对环境中所有微生物的遗传信息进行全面分析研究，而非依赖于对单个微生物进行培养和分离，以此来提高时效性。近年来，随着测序技术及信息化时代的飞速发展，将宏基因组学技术研究又推向了新的高潮。

2 mNGS技术的发展史

研究者Sanger提出的酶法测序[7-8]及Maxam和Gilbert等提出的化学降解法测序[9]标志着DNA测序时代的来临。以Sanger法为代表的一代测序技术可一次性对1条DNA分子进行测序，最长能测到1 000～1 500bp，对生物学研究具有重大意义。但因该技术成本高、速度慢等局限性，并不是最佳的测序方法。随着有关技术的不断研发，以Roche公司的454技术、Illumina公司的Soiexa技术和ABI公司的SOLID技术标志着第二代测序技术的诞生[8]。

mNGS是继Sanger测序后的一项新兴技术。mNGS是一种无偏差的检测病原体的方法，可一次性对几百万条到十亿条DNA分子进行并行测序，因此又称高通量测序。mNGS可分析自然界中99%尚未培养的微生物，直接对样本中的DNA或RNA进行高通量测序，能够快速、客观的一次性检测出样本中的多种病原微生物，为急危重症和疑难感染性疾病提供了诊断依据[10-11]。可见mNGS在提高病原体鉴定方面具有很大潜力。

宏基因组二代测序病原体检测包括样本采集、核酸提取、文库构建、高通量测序、生物信息分析和生成报告，检测全流程24～72h即可完成交付。Wilson等[12]2014年在《新英格兰医学杂志》发表了人类医学史首个利用mNGS在1名先天性免疫缺陷的14岁儿童脑脊液(cerebrospinal fluid，CSF)标本中找到钩端螺旋体特异序列，从此拉开了mNGS在临床应用的帷幕。

3 mNGS在儿童感染性疾病诊断中的应用

3.1 mNGS血浆游离DNA测序检测在儿童脓毒血症中的应用

脓毒血症是一种威胁儿童生命的感染性疾病，早期诊断并及早给予抗菌药物治疗是挽救生命的关键，而快速的病原学诊断可以帮助临床医生合理的使用抗菌药物。虽然聚合酶链式反应(PCR)技术在临床应用越来越成熟，但该方法仅局限于病毒及部分特定细菌的检测。2016年，Grumaz等[13]建立了一套完整的诊断工作流程，该流程基于mNGS血浆游离DNA(mcfDNA)进行无偏差序列分析，可以鉴定传统培养方法所遗漏的潜在细菌病原体，进而识别感染微生物。Abril等[14]报道了首次利用mNGS在重症脓毒血症患者的血浆中检测出了犬链球菌，并通过16SrRNA测序和血培养再次证实了是由犬链球菌引起的脓毒症感染性休克和多器官衰竭的病例。Long等[15]研究利用mNGS法和血培养对78例重症监护病房(ICU)中的患者血液进行分析，并通过PCR扩增/Sanger测序验证，结果显示mNGS的灵敏度优于血培养(30.77% vs.12.87%)，此外，mNGS还从14个标本中检测到15种病毒，而传统培养未检出，该研究表明mNGS在细菌、病毒检测方面更具优势，可有效地识别多种病原体感染。Goggin等[16]在一项研究中评估了游离DNA测序(mcfDNA-seq)技术检测血液系统肿瘤患者血浆中病原菌的敏感性和特异性，指出mcfDNA-seq可以预测75%复发性癌症患儿中血行感染(bloodstream infaction，BSI)的病原菌，特异性超过80%，首次验证了基于mNGS的mcfDNA在BSI发生前识别病原体的新假设，使预防性治疗成为可能。Timsit等[17]已经将mcfDNA的mNGS检测作为新的BSI早期诊断方法纳入专家共识，肯定了血浆mcfDNA的mNGS检测在临床病原微生物鉴定的良好前景[18]。

3.2 mNGS在儿童下呼吸道感染性疾病中的应用

呼吸道感染性疾病严重威胁儿童健康，造成了重大的社会经济负担。因此，病原体的早期识别和鉴定对于精准治疗至关重要。Wang等[19]对32例重症肺炎患儿的支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)样本，使用传统检测方法和mNGS进一步鉴定病原体，结果发现在全部32例BALF中，mNGS鉴定出包括腺病毒、肺炎支原体、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、巨细胞病毒和博卡病毒等；而在15例BALF样本中，传统检测法未发现常见病原体，表明mNGS可以提高患儿重症肺炎病原体检测的敏感性。Lin等[20]报道了1例经血浆mNGS诊断患儿嗜麦芽窄食单胞菌重症肺炎的案例，该患儿入院后行常规检查均为阴性，考虑患儿年龄小、病情重，不适合采集BALF样本，对其血液进行了mNGS检测，结果发现嗜麦芽窄食单胞菌为血液唯一细菌病原体，此外还发现几种真菌。mNGS在新型冠状病毒(COVID-19)肺炎疫情诊断中也发挥了重要作用。Ren等[21]利用mNGS技术，在5名重症肺炎患者的BALF中鉴定出了以前未知的冠状病毒，并通过Sanger测序确认了其基因组序列，最终证实COVID-19起源于蝙蝠。随后，Wu等[22]利用mNGS对死于COVID-19患者的肺和结肠转录组及蛋白组进行了分析，并对患者肺中严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)的宿主反应进行了详细评估，发现患者的死亡可能与宿主反应有关，而不是病毒感染爆发引起的，揭示了COVID-19的病理生理学，并为重症COVID-19疾病提供了潜在的治疗靶标。因此，对于不明原因的下呼吸道感染，mNGS将提高对儿科“未知”病原体的诊断率，可协助对新型病原体的鉴定。

3.3 mNGS在儿童中枢神经系统感染诊断中的应用

中枢神经系统感染性疾病是一种威胁儿童生命的常见神经科疾病，早期诊断困难，一旦发展到重症脑膜炎预后较差，可引起严重的并发症和后遗症。因此，及时准确的诊断方法和积极的抗生素治疗对改善其预后至关重要。Zhang等[23]在一项回顾性研究中首次分析了mNGS对脑膜炎患儿感染肺炎链球菌的诊断价值，在135例患者CSF标本中经mNGS鉴定出肺炎链球菌32例，利用临床微生物检测法(培养法或肺炎链球菌抗原检测法)和PCR进行验证，结果显示在病例26中通过培养法检测到肺炎链球菌，而PCR检测结果为阴性；在病例28中通过培养法检测到金黄色葡萄球菌，而PCR并未检测出病原菌，表明mNGS的灵敏度高于PCR。2020年潘春熹等研究表明，在使用抗生素后mNGS对病原体检测较传统方法有较高的灵敏度。Wang等[24]报道了1例用mNGS在患儿CSF样本中鉴定出罕见的解脲脲原体的病例，并通过PCR进一步证实，患儿得到迅速及时诊断，红霉素治疗4周后治愈，临床随访未见后遗症。因此，mNGS在中枢神经系统感染诊断中的应用具有重要价值。

4 mNGS应用于感染性疾病中存在的问题

4.1定植和感染的区分

对于呼吸道感染，mNGS在病毒及罕见病原体中具有较好的检测效能，但在细菌、真菌的检测中，尚不能准确判断菌群定植或感染状态，需要结合临床具体分析。近年来，临床微生物学实验室已开发出可将真正病原菌与培养皿中的定居者分开的程序，并且正在为mNGS开发类似方法[25]。另一种方法是监测和评估宿主的免疫反应[26]。这些方法可能需要进一步研究，以确定区分定植和感染的最佳方法。

4.2有关数据的储存和分析及数据库

mNGS在疾病诊断中的主要难题是能够将数据转化为与临床相关的信息。在储存和分析方面，mNGS生成的大量数据繁重，其中包括对主机的读取，可能涉及到患者的隐私问题。此外，需要快速的生物信息学工具进行数据分析，以获得可用于临床的结果。目前，临床实验室需要人工智能来补充生物学信息专业知识，有研究者建议使用K-聚物、标记和对比进一步对数据进行分析，以确保最高灵敏度和特异性[27]。最后，由于数据库中部分序列包含错误信息，可能导致假阳性结果，因此需不断更新数据。

4.3 mNGS报告的正确解读

对于临床医生而言，最大的挑战也许是对mNGS结果的解释，当前尚无统一标准，不能单纯只看检测值，还应结合参考值及感染灶进行综合分析，否则容易误判。为解决这个问题，一些机构建立了由医学微生物学、生物信息学、传染病专家及其它临床小组组成的医学团队，其可在出报告前进行讨论，并提供对mNGS结果的解读，这样可确保解读的报告与临床数据是相关的。

5展望

综上所述，mNGS作为一种新兴的病原微生物诊断技术，尚不能完全代替传统的诊断方法，但对于常规方法无法诊断的重症感染患儿，可作为一种补充手段来识别病原体。目前，mNGS技术在成人的应用中已经得到了专家的肯定，并被纳入了“宏基因组学测序技术在中重症感染中的临床应用专家共识(第1版)(李颖等2020年)”“中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识”及有关文献[17]，期待更多的临床研究来推广mNGS在儿童重症感染性疾病中的应用。