周珊珊，蒋永生，镇小蔓，焦礼诗，徐开达，梁 君，李 哲，周永东

（浙江省海洋水产研究所，浙江省海洋渔业资源可持续利用技术研究重点实验室，浙江舟山 316021）

曼氏无针乌贼Sepiella maindroni，属软体动物门Mollosca、头足纲Cephalopoda、十腕总目Decapodiformes、乌贼目Sepioidea、乌贼科Sepiidae，俗称墨鱼，属于中型乌贼，曾是我国“四大海产”之一，主要分布在中国浙江和福建沿海。由于过度捕捞和生境破坏等，严重破坏了近海乌贼的种质资源，导致曼氏无针乌贼产量连续下降，已无法形成渔汛。为恢复曼氏无针乌贼资源量，浙江、福建等地区开展了曼氏无针乌贼增殖放流工作，取得了一定的资源修复成效[1-4]。目前，曼氏无针乌贼的增殖放流主要是放流乌贼受精卵，但是附着的乌贼卵易被海水冲散或因环境因素而不能完全孵化[3,5-6]。放流怀卵亲体的方式则可使乌贼卵附着于自然生长基，从而提高乌贼增殖放流效果。

运输密度是影响黑鲷幼鱼Acanthopagrus schlegelii、尖吻鲈Lates calcarifer、黑尾近红鲌Ancherythroculter nigrocauda等鱼类死亡率的因素之一，且对乳酸、糖原、酶活等具有一定影响，乳酸、糖原、酶活等生理生化指标是反应机体能量代谢和应激情况的重要指标[7-9]。且谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）活力、超氧化物歧化酶（SOD）与硫化物、亚硝酸氮对曼氏无针乌贼的胁迫损伤密切相关[10-11]。乌贼亲体在放流运输过程密度过高易喷墨而造成亲体大量死亡，运输密度过低则增加了放流成本。目前，国内外学者的研究主要集中在乌贼生态学[12-13]、人工繁育[14-16]、生长发育[17-19]、资源分布[20]、分子生物学[21-22]等方面，但仍缺乏乌贼运输过程中密度对曼氏无针乌贼亲体死亡率及生存状态影响的相关研究。因此，本研究选用乳酸、糖原含量及谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（GOT）、碱性磷酸酶（ALP）、超氧化物歧化酶（SOD）活性为指标开展了不同运输密度下乌贼亲体死亡及机体情况的研究，查明运输密度对乌贼喷墨行为及生存状态的影响，分析高密度下曼氏无针乌贼亲体的死亡原因，量化不同密度下乌贼亲体的应激程度，为曼氏无针乌贼亲体的增殖放流运输过程提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 实验材料及驯化

实验所用曼氏无针乌贼亲体（以下简称乌贼）由浙江省海洋水产研究所试验场培育，每天定时06：00、17：00 投喂冰鲜饲料，饲喂后换水，用氧气泵不断向水中充氧，保持水中DO＞5.5 mg·L-1，盐度为27～28，pH 7.8～7.9，光照周期为12 L：12 D。

1.2 实验方法

根据预实验初步筛选后，本实验共设置6 个处理组，密度组梯度分别为0.2、0.6、1.2、1.8、2.4、3 ind.·L-1，每个密度组设置3 个平行。实验前将乌贼从暂养池中放到容积为8 L 的塑料桶中，将塑料桶放在乌贼放流船上并加以固定，实验跟随乌贼放流船运送至东极，模拟乌贼亲体放流运输过程（船速为20.742 4 km·h-1，风浪4～5 级），实验水体5 L，实验时间5 h。实验结束后将乌贼置于冰上，快速解剖取肝脏样品，每个密度组取1 只乌贼样品，乌贼全部死亡则停止实验并立即取样。各组间乌贼的平均胴背长为8.3～8.7 cm，胴背长各组间无显著性差异（P＞0.05）。实验平均水温约为25 ℃，持续充气DO＞5.5 mg·L-1，海水盐度、pH 同暂养池，实验过程不投饵。

实验过程中观察到乌贼浮于表面，鳍摆动停止，多次触碰无反应判定为死亡，记录对应时间并捞出。乌贼在虚弱时可能会喷墨，为减少墨汁产生的干扰，在乌贼喷墨后轻柔换水。乌贼经丁香酚快速麻醉后，测量体长和体质量（精确到0.1 cm）。随后置于冰上取样，取肝脏液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱。南京建成生物工程研究所试剂盒测定肝脏组织的乳酸、糖原含量及谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、超氧化物歧化酶（SOD）活性。

1.3 数据分析处理

数据的统计和分析采用SPSS 17.0 进行，并以平均数±标准误（mean±SE）表示，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）对乌贼胴背长、死亡率、糖原、乳酸、酶活等数据差异进行分析，以P＜0.05 作为差异显著标准。

2 结果

2.1 不同运输密度下乌贼的行为及死亡率

低密度运输时乌贼一般在水底静止或是缓慢游动（图1a），高密度运输情况下乌贼产生了一定的适应性行为（图1b），在运输密度达到1.2 ind.·L-1后乌贼就开始在水面附近活动，当运输密度继续增至2.4 ind.·L-1后乌贼大多在水面活动且出现个别乌贼跳出塑料桶的现象。乌贼在受到环境胁迫时可能会喷出墨汁，在1次或多次喷墨后死亡，最终浮于水面。

图1 不同密度下乌贼状态Fig.1 Behavior of S.maindroni in different densties

如图2 所示，随着乌贼运输时间增加，累计死亡率增加。乌贼在0.2、0.6 ind.·L-1密度下运输死亡较少，可以较长时间运输。在1.2、1.8 ind.·L-1密度下运输乌贼的死亡时间主要出现在运输2.5 h 后，2.4、3 ind.·L-1密度下运输2.5 h 后累计死亡率趋近于50%。密度越低出现死亡的时间越晚，2.4、3 ind.·L-1密度下最早在0.5 h 内出现死亡。运输时间达到1.5 h 后2.4、3 ind.·L-1死亡率显著高于其他处理组（P＜0.05），2.5 h 后1.2、1.8 ind·L-1死亡率显著高于0.2 ind.·L-1处理组（P＜0.05），4.5 h 后1.8、2.4、3 ind.·L-1死亡率显著高于0.2 ind·L-1处理组（P＜0.05）。乌贼不宜进行高密度运输，2.4、3 ind.·L-1的密度运输不宜超过2.5 h。

图2 乌贼在运输期间的死亡情况Fig.2 Deaths of S.maindroni at each transport time period

运输密度对乌贼死亡率的影响如图3 所示。乌贼的死亡数量随着运输密度的增加而上升，2.4、3 ind.·L-1处理组死亡率较高，显著高于其他处理组（P＜0.05）。1.8、1.2 ind.·L-1处理组死亡率显著高于0.6 和0.2 ind.·L-1处理组（P＜0.05）。

图3 不同运输密度下乌贼死亡率Fig.3 Death rates of S.maindroni in different densities

2.2 不同运输密度下乌贼糖原和乳酸含量变化

如图4 所示，不同运输密度影响乌贼肝脏乳酸含量，随着运输密度增加肝脏乳酸含量下降，其中0.6 ind.·L-1处理组乳酸含量最高为586.64 μmol·gprot-1，显著高于其他处理组（P＜0.05）；0.2 和3 ind.·L-1处理组显著高于1.2、1.8、2.4 ind.·L-1处理组（P＜0.05）。

图4 不同密度下乌贼（肝脏）乳酸含量Fig.4 Lactic acid content of S.maindroni in different densities

如图5 所示，运输密度增加乌贼肝脏糖原含量升高，0.2 ind.·L-1处理组糖原含量最低为38.66 mg·gprot-1，显著低于其它处理组（P＜0.05）；3 ind.·L-1处理组糖原含量最高为73.42 mg·gprot-1，显著高于其他处理组（P＜0.05）；0.6 ind.·L-1处理组肝脏糖原略高于1.2、1.8、2.4 ind.·L-1处理组，但无显著差异。

图5 不同密度下乌贼（肝脏）糖原含量Fig.5 Glycogen content of S.maindroni in different densities

2.3 不同运输密度下乌贼肝脏酶活的变化情况

如图6 所示，随着运输密度的增加碱性磷酸酶（ALP）、超氧化物歧化酶（SOD）的酶活呈M 型分布。0.2、3 ind.·L-1处理组ALP 酶活最低，分别为47.15、47.43 IU·gprot-1，显著低于其他处理组（P＜0.05）；1.2 ind.·L-1处理组ALP 酶活为51.82 IU·gprot-1，显著低于0.6、1.8、2.4 ind.·L-1处理组（P＜0.05）。0.2 ind.·L-1处理组SOD 酶活最低，为10.44 IU·mgprot-1，显著低于0.6、2.4、3 ind.·L-1处理组（P＜0.05）；0.6 和2.4 ind.·L-1处理组SOD 酶活最高，分别为12.26 和11.41 IU·mgprot-1，显著高于其他处理组（P＜0.05）。

图6 不同运输密度下乌贼（肝脏）SOD、ALP 含量Fig.6 Enzymatic activity of S.maindroni in different densities

如图7 所示，随着乌贼的运输密度的增加谷草转氨酶（AST）的酶活呈先上升后下降再上升的趋势。其中，0.2、2.4 ind.·L-1处理组AST 酶活分别为13.39、14.18 IU·gprot-1，显著低于其他处理组（P＜0.05）；0.6 和3 ind.·L-1处理组AST 酶活最高，分别为18.52 和18.26 IU·gprot-1，显著高于其它处理组（P＜0.05）。谷丙转氨酶（ALT）酶活随运输密度的增加而上升。其中，0.2、0.6、1.2 ind.·L-1处理组ALT 酶活最低（3.30、3.18、3.21 IU·gprot-1），显著低于2.4、3 ind.·L-1处理组（P＜0.05）；3 ind.·L-1处理组酶活最高（3.99 IU·gprot-1），显著高于0.2、0.6、1.2、1.8 ind.·L-1处理组（P＜0.05）。

图7 不同运输密度下乌贼肝脏ALT、AST 含量Fig.7 Enzymatic activity of S.maindroni in different densities

3 讨论

3.1 运输密度对乌贼行为及死亡率的影响

运输密度对水生生物在运输过程中的生存状态有重要影响，密度过高可能引起水质恶化导致鱼体受损[23]。实验发现曼氏无针乌贼在低密度运输过程中会在水底缓慢游动，高密度时则会减少游动并漂浮在水面上，且高密度下乌贼很快会喷墨。乌贼喷墨后逐渐虚弱最终死亡，这与虎斑乌贼Sepia pharaonis喷墨后生存状态变差类似[24]。运输密度对乌贼死亡率有显著影响，当运输密度达到1.2 ind.·L-1时死亡率显著上升，在2.4 ind.·L-1运输密度下死亡率达到75%。对卵形鲳鲹Trachinotus ovatus[25]和真鲷Pagrus major[26]运输胁迫的研究发现密度增加造成的水质恶化对鱼类的存活有一定影响[25-26]。乌贼死亡率上升可能与水质恶化及水体生存空间拥挤导致的应激反应有关。

密度越低出现死亡的时间越晚，在0.2 ind.·L-1密度下乌贼5 h 内未出现死亡，高密度（2.4、3 ind.·L-1）运输下30 min 已出现少量乌贼死亡。因此，曼氏无针乌贼运输时密度应不宜超过1.8 ind.·L-1且运输时间不宜超过2 h，长时间的乌贼运输应适当降低运输密度。

3.2 运输密度对乌贼糖原、乳酸含量的影响

糖原是动物体内主要的供能物质，一般存在于肌肉和肝脏中。在应激胁迫中肝糖原相较于肌糖原的供能优先级更高[27]。应激胁迫下鱼类通过升高血糖含量来保障鱼体能量供给[28]。在本研究中乌贼肝糖原含量上升可能是因为受到了运输和密度的胁迫，机体通过减少活动等适应性反应来保持肝糖原稳定，而3 ind.·L-1密度下乌贼糖原含量显著高于其他组可能是由于乌贼肝脏组织受损，导致无法正常代谢糖原。

鱼体缺氧情况下会通过糖酵解分解糖原产生能量并产生乳酸。水体溶氧含量低、鱼体剧烈运动等都可能是鱼体乳酸含量升高的因素[29]。在本研究中乌贼处于充氧状态下，1.2、1.8、2.4 ind·L-1处理组的乳酸含量低于0.2、0.6 ind.L-1处理组可能是因为高密度条件下乌贼活动空间减少，乌贼活动能力减弱从而减少了乳酸堆积。3 ind.·L-1密度下乳酸处于较高水平，可能与此密度下乌贼受密度胁迫造成了缺氧或生存空间挤压，部分个体浮于水面，水面较强的水流晃动增加了机体平衡所需的能量，从而导致了乳酸堆积。此外，当密度过高时，乌贼机体喷墨及高密度造成的水体污染可能造成了一定的机体损伤，从而引起肝脏组织的乳酸代谢紊乱。

3.3 运输密度对乌贼酶活性的影响

谷丙转氨酶（ALT）与谷草转氨酶（AST）主要分布在肝细胞内，肝细胞发生病变或坏死时ALT 和AST 酶活会升高，且升高的程度与肝细胞受损程度相一致，但当胁迫的程度继续增强可能造成机体肝细胞死亡导致酶活下降[11]。本研究中，随着乌贼运输密度的增加，ALT、酶活逐渐上升，AST 酶活在1.2、1.8、2.4 ind.·L-1密度下有所下降，与肝脏乳酸变化有一定相关性，表明一定密度条件下乌贼减少活动，降低代谢等减小肝脏受胁迫的程度。软体动物不具备特异性免疫，吞噬作用是其重要的防御机制中，碱性磷酸酶（ALP）是软体动物溶酶体酶的重要组成部分，异物被吞噬之后与溶酶体结合后被水解酶消化分解从而完成防御反应[30-31]。ALP酶随着乌贼运输密度的增加而升高，但在1.2、1.8 ind.·L-1组出现降低的情况，可能与此密度情况下减少机体代谢和活动水平，防御能力也随之降低有关。这与低浓度条件下亚硝酸氮对曼氏无针乌贼[10]胁迫、氨氮对栉孔扇贝Chlamys farreri[32]胁迫下ALP 的变化趋势一致。超氧化物歧化酶（SOD）可以防止机体受到自由基的损害，受到轻度逆境胁迫时，SOD 活性往往升高，而受到重度逆境胁迫时，SOD 活性降低，机体受到损伤[10]。在本研究中SOD 的活性呈“M”形变化，当密度达到0.6 ind.·L-1时SOD 显著上升后又显著下降，在达到2.4 ind.·L-1后又显著上升。这表明密度胁迫会对乌贼机体抗氧化活性产生影响，受轻度逆境胁迫导致SOD 活性上升，密度胁迫增加后肝脏功能受损导致SOD 活性下降。

4 结论

运输密度显著影响曼氏无针乌贼成活率，乌贼通过降低代谢、减少活动等来适应较高密度条件下的运输损伤。运输过程中密度过高引起的缺氧和水体恶化造成的肝脏损伤可能是乌贼死亡的主要原因，建议运输密度不宜超过1.8 ind.·L-1且运输时间不宜超过2 h，长时间运输应适当降低运输密度。