王淑林 张长平 翁崇双

不育症是指由于男性因素引起的不育，常与染色体异常、内分泌疾病、生殖道感染和输精道梗阻等因素有关，主要表现为无法使女性受孕，少部分患者可能存在性功能障碍、睾丸疼痛等[1-3]。近年来随着生活压力的增大及生活方式的改变，发病率呈逐年递增趋势。临床常通过精液常规参数分析评估男性生育能力，包括精子密度和精子形态等[4]。随着生殖医学发展，人们对受精能力的评估由精子外在形态向内在机制逐步转变。既往研究显示，男性不育症与精子凋亡调控失衡密切相关[5]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）作为一种蛋白质，在细胞凋亡中起着重要作用[6]。B 细胞淋巴瘤因子2（Bcl-2）具有较强的抑制细胞凋亡作用[7]。由此推测Caspase-3、Bcl-2 表达水平与男性不育有关。因此，本文旨在探究男性不育症患者Caspase-3、Bcl-2 表达水平及其与精液常规参数及精子DNA 完整性的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019 年5 月-2021 年5 月于上饶市妇幼保健院确诊的100 例男性不育症患者，根据世界卫生组织（world health organization，WHO）标准[8]将患者分为少精组58 例（精子浓度＜20×106/mL）和弱精组42 例（精子浓度≥20×106/mL），另随机选取在本院进行健康体检的56 例正常男性作为对照组。纳入标准：少精组和弱精组符合文献[9]临床对不育症诊断标准，婚后性生活正常、未采取避孕措施，＞1 年不育。排除标准：（1）合并生殖道外伤；（2）合并器质性疾病；（3）超声检查下睾丸、附睾、精索静脉和输精管未见明显异常；（4）临床资料不完整；（5）存在精神疾病。医院伦理委员会对本研究予以审核批准通过，患者及其家属了解本研究并知情同意。

1.2 方法

1.2.1 Caspase-3、Bcl-2 水平 观察组患者于入院当天，对照组患者于入院体检当天采集空腹静脉血3 mL，将标本放置在-40 ℃的条件下保存，待血液完全凝固后进行离心分离血清（离心半径8 cm，3 000 r/min，离心10 min），采用酶联免疫吸附试验法检测患者Caspase-3，试剂盒购自广州市锐博生物科技有限公司。采用免疫组织化学法检测Bcl-2。所有检测步骤严格按照说明书进行。

1.2.2 精液采集与处理 所有患者禁欲3～7 d 后于医院留取精液并置于室温下液化，并取部分进行精液常规检查。称量精液质量并计算精液体积，采用计算机精液分析系统（西班牙CASA 系统）计算精子浓度、精子存活率和精子前向运动率。

1.2.3 精子DNA 完整性 采用美国Irvine Scientific公司生产的ISOLATE 梯度液进行密度梯度离心，离心弃上层清液后留取0.5 mL 沉淀，上游法优选精子。采用流式细胞术检测精子DNA 碎片指数（DNA fragmentation index，DFI），仪器选择美国贝克曼FC500 生产的流式细胞仪，试剂盒为仪器配套的，操作过程严格按仪器与试剂说明书进行。检测精子流动速度2 min 后收集数据，精子核经过酸和染色处理后利用统计学软件计算精子DNA 完整性（DFI值），DFI＜15%为精子DNA 完整性较好。

1.3 统计学处理 本研究中所涉及的数据采用SPSS 22.0 软件进行分析，满足正态分布且方差齐的Caspase-3、Bcl-2、精液常规参数及DFI 值等计量资料采用（）表示，采用单因素方差分析比较三组间差异，采用Bonferroni 检验比较三组间两两差异；计数资料用率（%）表示，采用χ2检验；采用Pearson 相关性分析Caspase-3、Bcl-2 表达水平与精液常规参数及精子DNA 完整性的关系。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组一般资料比较 三组年龄、体重指数、禁欲时间、学历及吸烟史比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 三组一般资料比较

2.2 三组Caspase-3、Bcl-2 水平及DFI 比较 少精组及弱精组的Caspase-3、DFI 水平均高于对照组，Bcl-2 均低于对照组（P＜0.05），少精组Caspase-3、DFI 水平均高于弱精组，Bcl-2 水平低于弱精组（P＜0.05），见表2。

表2 三组Caspase-3、Bcl-2水平及DFI比较（）

表2 三组Caspase-3、Bcl-2水平及DFI比较（）

*与对照组比较，P＜0.05；#与弱精组相比，P＜0.05。

2.3 三组精液参数比较 少精组及弱精组的精液量、浓度、前向运动率及精子存活率均低于对照组（P＜0.05），少精组精液量、浓度、前向运动率及精子存活率均低于弱精组（P＜0.05），见表3。

表3 三组精液参数比较（）

表3 三组精液参数比较（）

*与对照组比较，P＜0.05；#与弱精组相比，P＜0.05。

2.4 少精组与弱精组Caspase-3、Bcl-2 与精液常规参数及精子DNA 完整性的关系 少精组与弱精组精液Caspase-3 与精液量、浓度、前向运动率及精子存活率均呈负相关，与DFI 呈正相关（P＜0.05）。Bcl-2 与精液量、浓度、前向运动率及精子存活率均呈正相关，与DFI 呈负相关（P＜0.05），见表4。

表4 少精组与弱精组Caspase-3、Bcl-2与精液常规参数及精子DNA完整性的关系

3 讨论

引起男性不育症的病因较为复杂，发病机制也尚未完全明确，现已成为男科领域中极其重要的研究热点。研究证实，男性不育与精液常规参数如精液量、浓度及活力有关[10]。另有研究表明，男性不育症的发病机制和病因与Caspase-3 及Bcl-2 紧密相连[11-12]。但临床关于Caspase-3 及Bcl-2 与精液常规参数和精子DNA 完整性具体关系的探讨尚存在一定争议。故本文旨在就其相关关系进行分析研究。

细胞凋亡是指机体为维持自身内环境稳定，而出现由基因控制的细胞自主且有序的死亡现象，可将机体内发育不良及变异的细胞主动从体内清除，严格控制正常细胞的增殖和衰老[13-14]。但凋亡过程中的紊乱可能会直接或间接导致相关疾病的发生，其中较为常见的即男性不育症，其是由于各种因素的影响使精细胞凋亡异常，精子含量减少而引起的[15]。细胞凋亡过程中受到多种蛋白的调控，最为关键且重要的是Caspase-3、Bcl-2。本研究中，少精组及弱精组的Caspase-3 水平均高于对照组，Bcl-2 均低于对照组（P＜0.05）。少精组Caspase-3水平高于弱精组，Bcl-2 水平低于弱精组（P＜0.05），提示男性不育症患者的精子含量越少，Caspase-3越高，Bcl-2 越低。Caspase-3 作为介导凋亡信号的关键下游分子，在多种凋亡过程中起着承上启下的作用。既往研究显示，Caspase-3 水平增加与男性不育症患者精子密度减低有关[16]。在正常情况下，机体细胞内存在对Caspase 酶的抑制剂，以降低其被激活时对细胞造成的损伤。但当Caspase-3水平异常升高或抑制剂的水平不足时，会造成细胞凋亡现象，引起精子含量减少，促使男性不育症的发生发展。Bcl-2 作为一种癌基因，可抑制细胞凋亡。Bcl-2 可与Bcl-2 家族的抑制细胞凋亡基因（Bcl-X1）、凋亡相关基因Bcl-X 的突变微基因（Bcl-Xs）等形成同源的蛋白二聚体，而特定的同源二聚体可作为细胞凋亡信号通路上的分子开关[17]。因Bcl-2 可与促凋亡BaX 形成二聚体，若Bcl-2 水平降低，则BaX 相对量高于Bcl-2，BaX 同二聚体的数量增多，从而促进细胞凋亡，引发男性不育。

本研究中，少精组及弱精组患者的DFI 水平均高于对照组，精液量、浓度、前向运动率及精子存活率均低于对照组（P＜0.05）。说明男性不育症患者精子DNA 受到损伤，精子发育水平及线粒体功能下降。临床常用DFI 表示精子DNA 的完整性，精子DNA 完整性是保证遗传物质成功传递的重要前提，但由于环境与基因改变、染色体异常等常导致精子鱼精蛋白缺乏，造成精子DNA 损伤，出现DNA 碎片化的现象，使DFI 水平升高[18]。精子在进入附睾的过程中会逐渐成熟，但也伴随着精子的氧化受损和细胞凋亡，精子在附睾内停留的时间越长，精子氧化受损程度越严重，使精子活力下降，线粒体功能减退[19]。而精子线粒体代谢功能下降会加重DNA 损伤并影响精子前向运动水平，故引起精液常规参数水平的下降。本研究中，精液量、浓度、前向运动率及精子存活率与Caspase-3 呈负相关，与Bcl-2 呈正相关，DFI 与Caspase-3 呈正相关，与Bcl-2 呈负相关（P＜0.05）。提示男性不育症患者Caspase-3、Bcl-2 表达水平及与精液常规参数、精子DNA 完整性密切相关。因Caspase-3 及Bcl-2表达水平异常均会造成细胞凋亡的发生，损伤睾丸生精功能。而细胞凋亡主要发生在精原细胞和精母细胞，导致精子数量的产生减少，活力降低。而研究表明，精子活力与DFI 水平呈负相关，且精子DNA 完整性异常会降低精子存活率[20]，进一步说明男性不育症患者Caspase-3、Bcl-2 表达水平可反映精子DNA 完整性及精液常规参数。

综上所述，男性不育症患者Caspase-3 水平呈现高表达，Bcl-2 呈低表达，且Caspase-3 与精液常规参数均呈负相关，与DFI 呈正相关；Bcl-2 与精液常规参数均呈正相关，与DFI 呈负相关。临床可通过检测Caspase-3、Bcl-2 水平评估男性不育症患者的精液质量和生育能力。本研究不足之处在于纳入样本量偏少，结果存在单一性，临床应扩大样本量深入研究证实。