＊郭欢欢 胡运琪 闻颖 马晓莉 南泽东 江志波

（北方民族大学 化学与化学工程学院 宁夏 750021）

随着生物化学、微生物学和有机化学基础理论发展以及生物技术的进步，20世纪40年代起，人们开启科学抗生素的黄金时代，抗生素的发展历史揭开了崭新的一页[1]。从青霉素、链霉素作为临床使用，到后来金霉素、氯霉素、土霉素、制霉菌素、红霉素、卡那霉素、头孢菌素等的问世及临床，使当时的细菌性疾病与立克次氏体病感染治愈率升高。然而20世纪80年代以来，获准上市的新抗生素数量在持续的下降[2]。简单途径获得的微生物资源，在过去的半个世纪里，已经被大量发掘和多次重复分析，新活性抗生素发掘困难，导致许多大型药企纷纷放弃微生物来源的抗生素研发[3-5]。

近年来人们将研究目标转向从未被开采的特殊生境微生物资源[6-11]。我国有较多沙漠、洞穴、海洋、盐碱地等特殊环境，蕴含微生物资源丰富，从特殊生境微生物的次级代谢产物中寻找结构新颖的活性化合物成为抗耐药菌药物研发的重要途径之一。例如，从特殊生境中发现的微生物枯草芽孢杆菌中分离得到的和田霉素系列化合物具有很强的抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MASA）活性[12]；从西藏芽孢杆菌分离得到的Amicoumacin类化合物，对表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌具有较强的抑制活性[13]；从塔克拉玛干沙漠沙生植物中分离到的菌株中产生的蔷薇霉素具有广谱抗菌活性[14]。

青海省柴达木盆地是一个被昆仑山、阿尔金山、祁连山等山脉环抱的封闭式盆地，盆地整体形状大概呈三角形，面积约24万平方千米，是中国三大内陆盆地之一。柴达木盆地属于高原大陆型气候，干旱是主要特点。年降水量由盆地东南部至西北部递减，年相对湿度为30%～40%，最小可低于5%。干旱荒漠是整个盆地的主要自然景观，主要土类有盐化荒漠土和石膏荒漠土和盐湖。高盐环境下微生物为了适应环境会分泌一些盐转运物质以保持胞内电解质平衡。因此，柴达木盆地微生物结构和种类与中性温和环境中可能不相同。

本文以采集于大柴旦木湖四份盐湖土壤为研究对象，借助于微生物分离和培养方法，获得了38株微生物，包括25株真菌和13株放线菌。利用乙酸乙酯萃取或者固相色谱萃取法，提取上述菌株的发酵产物，并在金黄色葡萄球菌模型上评价抗菌活性，发现7株菌株代谢产物对金黄色葡萄球菌具有不同程度的生长抑制作用。

1.实验材料与方法

(1)材料

①仪器、药品与试剂

A.仪器

SHKTYQ电热恒温培养箱（5～60℃）：山东潍坊生物仪器有限公司；HZQ-F恒温振荡培养箱（5～60℃），DL-CJ-1ND超净工作台（100级@≥0.5μm）：哈尔滨东联仪器厂；低温冰箱（-50～-86℃）：SANYO，MDF-382E(N)（日本）；高压灭菌锅（105～136℃）：SANYO，Antoclave MLS-3250（日本）。

B.药品和溶剂

乙酸乙酯（AR）、甲醇（AR）等化学试剂由国药集团提供；葡萄糖（BR）、琼脂（BR）、硫酸镁（AR）、磷酸氢二钾（AR）、重铬酸钾（AR）、青霉素（BR）、链霉素（BR）、结晶紫溶液（BR）（0.05%）等购置于Sigma公司。TRYPONE（BR）、酵母浸膏（BR）等购自于上海恒远生物科技厂。上述药品及试剂无特殊说明均为AR级。

②土壤样本采集

A.土壤样本，2019年08月采集于青海省海西蒙古藏族自治州大柴旦镇大柴旦木湖湖边（东经96°23′22.2″；北纬37°35′34.9″，海拔3387.3m），采集地表下40～60cm深土壤。

③培养基

本实验使用的培养基包括：高氏l号培养基[9]，马铃薯培养基[9]，马丁培养基[10]，MH肉汤培养基[9]，Luria-Bertani（LB）培养基[9]。

(2)实验方法

①样品采集地点和采集方法

采用5点采集法，取地面下40～60cm深度的土壤。将土壤样品上下均匀混合后装入无菌信封，标注采样信息，所有样品低温保存。

②样品处理

A.土壤样品处理超净台中，取四份土壤样品各10g，加入90mL无菌LB液体培养基，混合均匀。依次稀释至0.01g/mL和0.001g/mL。

B.菌株生长取两种质量浓度悬浊液200μL涂布在固体平板上。静置半小时后，倒置于恒温培养箱中，28℃进行培养。马铃薯培养基15～20天，高氏一号培养基5～7天，期间观察菌落生长情况。

③菌株分离

用无菌竹签挑取单菌落，固体培养基“Z”划线培养。放线菌使用高氏一号培养基；真菌使用马丁培养基，重复3次，直至菌落在显微镜下观察无异性菌。

④菌株保存

确定为单一菌落的菌株利用无菌竹签接种至斜面培养基，正常生长至生长期，4℃冰箱保存；对于产孢放线菌使用20%甘油洗涤孢子，低温冰箱中保存；产孢真菌使用50%甘油洗涤孢子，保存于低温冰箱中。

A.光学显微镜镜检

超净台中，将灭菌的盖玻片45°斜插入各个培养基中，每个培养基插入3～5片，放入恒温培养箱中培养1～2天，根据菌株生长情况取盖玻片进行显微镜观察，保存菌丝体清晰的图片，并记录。

B.电子显微镜成像

将导电胶于超净台中紫外灯照射灭菌，用无菌牙签挑取单菌落，将单菌落均匀涂抹在导电胶上。蔡司扫描电子显微镜（EVO MA 10/LS 10型）观察视野中完整菌株，分别获取×50，×200和×2000倍图像。以图片编辑工具给出菌株的直径（或长、宽），记录菌株的形态。

⑤活性评价方法

A.样品制备

固体发酵琼脂块捣碎，乙酸乙酯超声萃取三次，每次20mL。合并有机溶剂，减压蒸馏回收有机溶剂。残留物以2mL甲醇溶解，作为待测液。

液体摇瓶发酵液10mL，上样至固相萃取色谱柱中，以10mL蒸馏水洗涤后，依次使用2mL的50%和95%甲醇水溶液洗涤，减压干燥，样品存放于玻璃瓶中，于4℃下保存。

B.活性测试方法

直径6mm的加厚滤纸上滴加200μL样品，自然风干（2h），并平铺于检定菌（金黄色葡萄球菌）的平板上。金黄色葡萄球菌检定板于28℃恒温培养箱中培养12～24h。观察样品的抑菌情况。

2.结果

(1)菌株分离与培养

大柴旦木盐湖位于柴达木盆地北部，含有丰富的无机矿石，属硫酸盐型盐湖，富含钾、锂，尤以蕴藏固体硼矿资源闻名于世，该地区土壤微生物分离工作还未见报道。本文利用放线菌和真菌培养方法，从四份盐湖土壤样品中共发现了38株菌株，其中真菌25株，放线菌13株（图1）。

图1 代表性菌株生长图片

真菌菌落宽大，直径普遍大于20mm，最大菌落达90mm。通常三个菌落成簇出现，菌落突起，有些菌落表面有水珠，边缘清晰或不规则。有气生菌丝，颜色各不相同，淡黄色居多。其中菌株1有明显的同心环，基底有灰色分泌物，而菌株22中心具有黑色素分泌，边缘菌丝体显淡粉色。放线菌菌落直径明显小于真菌，2～15mm，多数小于10mm。放线菌菌落表面平坦，较集中，采用划线法接种时菌落沿划线分布，通常有黄色水溶性分泌物产生。

(2)抑菌活性评价

利用平板牛津杯法检测抗菌活性。结果显示2株真菌和4株放线菌发酵产物具有不同程度抑制金黄色葡萄球菌生长作用。提示这些菌株可能具有发掘新抗生素的潜力。

3.讨论

柴达木盆地属于干旱的内陆型高原盆地，位于我国西北部，是中国四大盆地中地势最高的盆地，海拔在2600～3000m之间，属于高原大陆型气候，以极其丰富多样的矿产资源而闻名于世，因为其特殊的地理位置、地质原因和气候原因,盐渍化是柴达木盆地的主要特征。高原地带由于常年高蒸发量和低降雨量，产生了大量的盐湖。其中大柴旦木湖荒漠干旱、极干旱气候，年均气温1.6℃，年降水量80.8mm，年蒸发量2031.8mm。据调查，湖水矿化度343.89g/L，阳离子Na+、K+、Mg2+含量分别为98216mg/L、6243.7mg/L、17873mg/L，阴离子Cl-、SO42-含量分别为183018mg/L、35869mg/L；Li、B2O3、Br含量分别为275mg/L、71.7mg/L、71.7mg/L，属于典型的矿物质盐湖。长期以来人们对大柴旦木湖矿物质的研究进行了大量的工作，但是对其中微生物多样性研究尚未见报道。本文对大柴旦木湖四份盐湖土壤样品中的放线菌菌株和真菌进行了分离并对其抑菌活性进行的测定和评价，这种极端的环境下生存的微生物是发现新结构天然产物的潜在资源。

4.结论

本文通过设定真菌和放线菌分离和培养方法，对采集于青海省大柴旦木湖盐湖土壤微生物进行了系统分离，从中获得了38株菌株，其中真菌25株，放线菌13株。利用牛津杯法对菌株进行了抑菌活性评价，发现2株真菌和5株放线菌的代谢产物具有明显的抑制金黄色葡萄球菌生长的活性。本文的工作对研究高原盐湖生物多样性和发掘新型抗生素奠定了基础。

5.致谢

本文致谢宁夏医科大学药学院吴秀丽教授及其课题组在样品采集方面提供的帮助。