赵钟毅，吕 荞，闭璟珊，文崇利，朱远致，韦正吉，邹联斌 ，郑 威，苏姣秀，尹德玮，郑 敏，胡传活

(1. 广西大学动物科学技术学院，广西 南宁 530005；2. 广西动物疫病预防控制中心，广西 南宁 530001 ；3. 中国农业科学院水牛研究所，广西 南宁 530000)

口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病[1]。FMDV是一种单股正链RNA病毒，编码4种结构蛋白(Structural proteins，SPs)VP1、VP2、VP3和VP4,以及10种非结构蛋白(Non-structural proteins，NSPs)L、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D、3AB和3ABC[2]。传统灭活疫苗工艺步骤在于对抗原的纯化以及去除包括NSPs在内的残留污染物，但由于抗原纯化不彻底，残留的NSPs等污染物会导致传统灭活疫苗在区分感染动物和免疫动物时存在较大的干扰[3]。口蹄疫 O型、A型二价3B表位缺失灭活疫苗(O/rV-1株+A/rV-2株)是近几年新研发的一种基因缺失标记疫苗。与传统灭活疫苗相比，该疫苗具有以下特点：一是抗原谱广，通过对VP1基因上抗原表位进行人工改造，对我国目前流行的缅甸98、CATHAY、泛亚和IND2001等谱系O型毒株均能提供较强保护力；二是通过人工缺失NSP 3B上的优势抗原表位，免疫动物不会产生该表位的抗体，因此可有效区分疫苗免疫动物和感染动物。所以应用该基因缺失苗更有利于FMD的净化和无疫区的建设。奶水牛是广西优势畜牧产业，由于其个体较大，野性较强，传统上通过采集牛食道-咽分泌液(Oesophagus-pharyngeal，OP)进行FMD病原学检测的困难较大，因此临床实践中迫切需要一种更好的FMD监测方法，以及疫苗和鉴别检测方法。

本试验旨在评价口蹄疫 O型、A型二价3B表位缺失灭活疫苗对奶水牛临床应用的安全性和有效性，并考察多次免疫该疫苗的动物是否仍能与感染动物有效区分，从而为开展奶牛场、种牛场FMD的净化以及建立无FMD养殖小区和FMD无疫区探索可行的技术方法。

1 材料与方法

1.1 疫苗 口蹄疫O型、A型二价3B表位缺失灭活疫苗(O/rV-1株+A/rV-2株)(生产批号：1909001)和口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗(O/HB/HK/99株+AF/72株)(生产批号：1911001)，由中牧股份兰州生物药厂提供。

1.2 检测试剂 口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒(生产批号：20201106101-1)、口蹄疫A型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒(生产批号：20201111103-2)、口蹄疫3ABC感染抗体检测试剂盒(生产批号：20200804129)，均由中国农业科学院兰州兽医研究所生产；口蹄疫病毒通用型实时荧光RT-PCR检测试剂盒(生产批号：FMDV20200708P)，购自哈尔滨元亨生物药业有限公司。

1.3 试验动物及分组 由广西水牛研究所种牛场筛选健康状况良好，90～100日龄，且尚未接种过任何FMD疫苗的奶水牛犊牛24头。随机分为2个组，一组为试验组(12头)，接种表位缺失疫苗，另一组为对照组(12头)，接种常规灭活疫苗。标记每头犊牛并记录耳号，确保血清与耳号能一一对应。试验组和对照组所有犊牛在同一牛舍内按照相同方式饲养。

1.4 免疫程序 为避免母源抗体干扰，根据前期抗体检测结果，所有犊牛在90～100日龄开展首免；首次免疫(首免)后30 d进行二次免疫(二免)，二免180 d后进行三次免疫(三免)。按照疫苗说明书，首次免疫和加强免疫的接种剂量均为每头2 mL，颈部肌内注射。

1.5 免疫安全性 所有试验动物每次免疫后就地观察2 h，如无异常症状出现则由饲养员继续观察，免疫后48 h内回访1次。对所见或回访症状及时记录，除正常反应(免疫后精神沉郁、食欲减退；体温升高1 ℃以内，不给药2 d内恢复正常)外，出现下列症状之一者被视为免疫不良反应。应激反应：有较重的临床症状，需要药物治疗才能恢复正常。过敏反应：免疫后短时间内出现突然倒地、口吐白沫、呼吸急促等严重且剧烈的反应，若治疗不及时可能出现死亡，2 d内出现死亡的均归为过敏反应死亡。

1.6 日常管理 按牛场饲养程序正常喂养和管理，定期巡查，注意观察牛只是否出现流涎，口腔、鼻镜、舌部、乳房、蹄部是否出现水泡、破溃等疑似FMD症状，若有则及时采样检测。

1.7 样品采集时间 分别于首免当日，首免后30 d，二免后30、60、90、120、150 d和180 d，三免后30 d和60 d，对试验组和对照组全体犊牛进行采血，分离血清，-20 ℃冻存，统一进行抗体检测。分别在首免当日、二免后120 d和三免后60 d，对试验组和对照组全体犊牛进行OP采集，-80 ℃冻存，统一进行FMD病原学检测。

1.8 血清抗体检测 采用口蹄疫O型、A型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒检测免疫抗体效价，FMD O型、A型抗体效价≥1∶128判定为免疫合格。采用口蹄疫3ABC感染抗体检测试剂盒检测感染抗体，阻断率(PI)≥50%判定为FMDV NSP 3ABC抗体阳性。

1.9 FMD病原学检测 按试剂盒说明书操作，采用荧光RT-PCR方法检测OP中FMDV核酸。

1.10 数据处理 采用SPSS 21软件对试验数据进行统计分析，抗体效价用“平均值±标准差”表示。采用GraphPad Prism 8.3对试验数据进行图像处理和差异性比较，P>0.05表示差异不显著，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 免疫安全性检验 临床观察结果显示，2个组所有犊牛接种疫苗后均无观察到任何明显的不良反应，动物各项指标正常，表明2种疫苗均安全可靠。

2.2 抗体检测 免疫抗体检测结果如图1和表1所示，免疫前2个组的O型和A型平均抗体均在4.0 log2左右，各组间抗体水平差异不显著(P>0.05)。首次接种疫苗后，2个组犊牛免疫抗体水平迅速提高；二免后免疫抗体水平进一步提高，并在二免后30 d达到高峰，试验组和对照组O型抗体平均滴度分别为9.9 log2、8.5 log2，试验组和对照组A型抗体平均滴度分别为9.0 log2、6.4 log2，此后逐步缓慢降低，但抗体滴度仍能维持较高水平；三免后抗体滴度再次提升，试验组和对照组A型抗体滴度均在三免后30 d达到最高峰，平均值分别为9.8 log2和7.0 log2。从抗体合格率看，对照组首免后30 d的O型和A型免疫抗体合格率分别为33.3%、25.0%，二免后30 d及三免后30 d时O型和A型免疫抗体合格率均为75.0%、58.3%；试验组首免后30 d的O型和A型免疫抗体合格率分别为50.0%、58.3%，二免后30 d及三免后30 d的O型和A型免疫抗体合格率均达到100%。从抗体滴度看，在免疫后各个时间点试验组O型抗体平均滴度均显著(P<0.05)甚至极显著(P<0.01)高于对照组；除在首免后30 d以及二免后120 d，对照组和试验组A型抗体平均滴度差异不显著(P>0.05)外，在其他时间点试验组A型抗体平均滴度均显著(P<0.05)甚至极显著(P<0.01)高于对照组。

表1 各组FMD灭活疫苗免疫合格率

图1 FMD O型、A型对照组和试验组各时段的抗体效价消长曲线

2.3 3ABC抗体检测 分别检测首免后30 d、二免后30 d和三免后30 d血清中3ABC抗体，如表2所示，只有对照组中1头牛在三免后30 d检出3ABC抗体阳性，阳性率为8.3%，其他样品均为阴性。

表2 各组FMD NSP 3ABC抗体检测

2.4 病原学检测 整个试验期间，未观察到试验组和对照组牛出现典型的FMD症状。同时，采用荧光RT-PCR方法对首次免疫当日、二免后120 d和三免后60 d采集的OP进行检测，结果均为阴性，表明所有试验牛均未感染FMDV。

3 讨论

FMD是我国重点防控的动物疫病，其疫苗研究、生产和运用受到高度重视，科学选择并合理使用疫苗显得尤为重要。当前国家要求种畜养殖场开展FMD等疫病净化，鼓励有条件的养殖场和地区创建无疫养殖小区和无疫区，因此研制一种安全、高效，并能有效区分免疫动物和感染动物的疫苗对预防和控制FMD的流行具有十分重要的意义。

对于疫苗而言，安全性是首先需要考虑的因素。过去的FMD疫苗在临床应用中免疫副反应较多，严重时可导致动物死亡，使得免疫工作受到很大影响。FMD疫苗副反应主要与疫苗中杂蛋白和内毒素的含量有关，疫苗中杂蛋白和内毒素的含量越高则越有可能导致注射后局部剧烈肿胀、不易吸收，免疫动物体温持续升高、食欲减退或停食等副反应发生[4]。近年来，随着疫苗生产企业工艺的改进，尤其是抗原超滤浓缩技术的广泛应用[5]，FMD疫苗中杂蛋白和内毒素的含量大幅降低，疫苗副反应也显著减少。本试验发现，无论是试验组还是对照组，犊牛在3次接种疫苗中均未出现明显的不良反应，表明2种疫苗的安全性均良好。

免疫抗体检测结果表明，两组犊牛在接种疫苗后均能产生特异性免疫应答，但抗体水平存在差异。在抗体平均滴度方面，试验组在首免后30 d、二免后30 d和三免后30 d时O型抗体平均滴度分别达到7.6 log2、9.9 log2、9.8 log2；A型抗体平均滴度分别达到6.5 log2、9.0 log2、9.8 log2；而对照组O型抗体平均滴度分别只有5.6 log2、8.5 log2、8.1 log2；A型抗体平均滴度分别只有4.9 log2、6.4 log2、7.0 log2；试验组抗体比对照组高1.4～2.8个滴度。统计分析发现，在本试验涉及的9个免疫后时间点试验组O型抗体平均滴度全部显著(P<0.05)甚至极显著(P<0.01)高于对照组，在7个免疫后时间点试验组A型抗体平均滴度显著(P<0.05)甚至极显著(P<0.01)高于对照组。试验组在首免后30 d、二免后30 d和三免后30 d时O型、A型抗体合格率分别达到50.0%、58.3%，100%、100%和100%、100%；而对照组分别仅为33.3%、25.0%，75.0%、58.3%和75.0%、58.3%；试验组抗体合格率比对照组高25%～41%。从抗体持续期看，试验组在二免后180 d时O型、A型抗体平均滴度仍维持在8.8 log2和7.0 log2，抗体合格率仍高达91.7%和83.3%；而对照组O型抗体平均滴度在二免后90 d就低于7.0 log2的合格线标准。上述结果表明，无论从抗体平均滴度、抗体合格率还是抗体持续期看，试验组均优于对照组。另外，本试验发现首免后30 d时，尽管试验组抗体水平优于对照组，但2个组的抗体平均合格率均未达到70.0%的群体合格标准，表明疫苗尚有改进空间，在临床实践中仍有必要进行加强免疫以获得较可靠的免疫保护效果。

3ABC、2B等是FMDV增殖过程中产生的主要NSPs[6]，接种疫苗可诱导动物产生针对SPs的抗体，FMD感染动物会产生针对SPs和NSPs的抗体[7]，而FMD疫苗生产过程中上述NSPs被去除，因此疫苗免疫动物理论上不会产生NSPs抗体。近年来，FMD NSPs抗体水平是开展FMD监测净化工作的关键性指标。世界动物卫生组织(OIE)规定无FMD和免疫无疫国家和地区，必须证明动物群体没有NSPs抗体[8-9]。目前，检测NSPs抗体也成为国内众多养殖场户和动物疫控机构开展FMD监测的重要手段。但是近年来发现由于工艺和成本因素限制，疫苗中始终会存在痕量NSPs，虽然新型的病毒样颗粒亚单位疫苗[10]以及基于多表位的重组疫苗[11]均不含NSPs成分，但目前这些新式疫苗仍无法取代灭活疫苗所产生的免疫效果。在这种情况下，种畜、乳畜等饲养周期较长，疫苗残留的NSPs在反复接种后可能在一些牲畜体内诱导产生NSPs抗体[12]，从而对监测净化工作造成干扰。为了区分感染动物和免疫动物，将接种疫苗的动物中检测到的NSPs抗体称为假阳性[13]。本试验所用的标记疫苗是一种人工缺失NSP 3B优势表位的基因缺失苗，并有配套血清学检测相适配。该疫苗优势在于不需要从疫苗抗原中去除NSPs。因此能降低疫苗生产成本，还可以提高疫苗免疫效力，克服传统疫苗的不足[14]，使用后免疫动物不会产生相应的抗体，充分满足区分免疫动物和感染动物的需要。从本试验结果看，常规疫苗在3次免疫后，8.3%的犊牛出现NSPs抗体。虽然该常规灭活疫苗达到了OIE对疫苗抗原纯净度检验(1/8以下阳性率)的要求，但仍可能会对监测评估产生不利影响。而口蹄疫O型、A型二价3B表位缺失灭活疫苗免疫动物后3ABC抗体检测均为阴性，进一步证明该标记疫苗配合相应鉴别诊断试剂盒，能满足区分感染动物和免疫动物的需要，从而大大简化了FMD监测净化工作。

本试验在奶水牛中对2种不同FMD灭活疫苗的安全性，以及诱导的免疫抗体和NSPs抗体水平进行评估比较，证明与常规灭活疫苗相比，本试验使用的口蹄疫O型、A型二价3B表位缺失灭活疫苗具有相同的安全性和更好的免疫保护效果，能诱导更高的抗体效价和更长的免疫持续期，并能满足区分感染动物和免疫动物的需要。本试验结果为进一步完善FMD监测和防控提供科学依据。