溃疡性结肠炎体外模型研究进展

2022-12-07白金霞卢美琪

山东第一医科大学(山东省医学科学院)学报 2022年8期

白金霞张婷卢美琪卢贞

1.新泰市人民医院，山东泰安 271200；2.山东省康复医院，山东济南 250109；3.山东中医药大学附属医院，山东济南 250014

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种累及结肠、直肠的慢性非特异性炎症性疾病，UC的临床表现主要包括腹痛、腹泻、便血、发热、关节疼痛等［1］。研究证实，基因、环境、肠道微生物和自身免疫因素共同参与UC 的发病［1-2］。据推测我国UC 患病率为11.6/10万［3］，并且随着国人饮食结构和生活方式的改变，近年来UC 发病率逐年增高［4］，例如在我国香港地区UC 的发病率从1997 至2006年增长了近3 倍［5］。UC 对患者的生活、工作造成严重影响，且一旦起病往往迁延难愈，而长期UC患者又有着较高的癌变风险［6］，对患者及其家庭带来了巨大的心理负担。UC 的治疗已成为广大临床和科研工作者亟待解决的医学问题。

目前，人们对疾病的研究以及药物等对疾病的治疗作用主要从3 个方面进行：一是在国家法律和社会伦理规定的范围内，在临床开展试验直接对患者进行相应生化指标、组织学或病理学等方面的检测，还可进一步对患者使用药物和各种治疗方法进行干预；二是在遵守实验动物3R 原则和相关条例的前提下，进行药理、毒理、代谢等动物实验以获取相应数据；三则是在体外进行实验，即选用离体组织、细胞或采用相关细胞复制疾病模型，以观察药物或各种致病因素对模型的干预情况。体外实验具有实验时间短、操作便捷、易于观察、可控性好、减少实验动物的使用等优点，但体外实验的研究结果能否完全推及到完整生物体内，仍需进一步实验以验证。就UC 而言，研究多集中于临床试验和动物实验，而在体外实验层面的文献相对较少，故现将通过细胞实验体外评价抗UC的研究作一综述。

1 UC模型细胞株的选择

在建立某一体外细胞模型时，首先要对细胞株进行选择，这主要取决于药物的作用机理及其目标作用部位，通常选择药物作用于机体所在部位的组织细胞，以更好地模拟出药物作用于机体体内目标部位的效果［7］。UC病变主要累及结肠和直肠，但由于体外原代培养结肠上皮细胞存在技术上的难关，现在主要使用结肠癌细胞株进行研究［8］。人结肠腺癌细胞系Caco-2来源于人类直肠和结肠癌细胞，在标志酶、形态学的功能表达及渗透性等方面与小肠上皮细胞具有相似性［9］。因培养在微孔滤膜上的Caco-2 细胞构建的药物体外吸收过程与口服药物在肠道的吸收过程具有良好的相关性，Caco-2 细胞已经成为研究药物吸收、代谢最经典的体外模型之一，也是目前为止最好的肠道转运模型和上皮转运模型。研究发现，Caco-2细胞能被多种因素诱导促进炎症因子的释放，众多国内外研究者将其用作UC 体外模型的复制。唐立海［10］观察了中药汤剂溃结灵的含药血清对Caco-2细胞炎症模型NF-κB p65结合活性的影响等，在细胞层面探究UC 的发病机制、溃结灵对UC的治疗作用以及溃结灵对UC治疗的可能作用机理。Violeta 等［11］对Caco-2 细胞复制的炎症条件下肠上皮的屏障功能开展实验，并阐述了其作为良好肠屏障模型的依据，具体表现为具有功能性细胞旁连接和顶端膜上发育良好的微绒毛等。兰丹凤［12］将Caco-2细胞培养、融合、分化，形成肠上皮细胞屏障，并在IL-1β的刺激下，建立起炎症损伤模型，对GC-C 信号通路对人肠上皮细胞屏障的影响及在炎症损伤中的作用进行了研究。

同样源自人结肠癌细胞的还有HT-29人结肠癌上皮细胞株。沈洪等［13］对清肠化湿方基于NF-κB/Tolls 通路治疗UC 的作用机制研究正是采用HT-29细胞株制备炎症模型进行的。此外，王庆文［14］的研究通过脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导HT-29的实验反应，证实了朊蛋白表达量低的细胞株更容易被诱导出促炎症因子这一结论。除此之外，人急性粒细胞白血病细胞系THP-1细胞也被用作UC 细胞模型的建立［15-16］，但研究数量相对较少。

RAW264.7 细胞作为一种巨噬细胞，能被LPS诱导产生促炎因子，是体外研究炎症反应及抗炎机制的一种普遍模型［17］。一项研究对巨噬细胞RAW264.7被诱导后产生的促炎细胞因子表达差异及NF-κB p65 磷酸化水平高低等方面进行比较，证实了鹅掌楸苷的体外抗UC 的活性［18］。Mutenta等［19］考虑抗炎症反应是炎症性肠病的治疗靶点，以LPS 诱导RAW264.7 巨噬细胞为模型，研究发现了一种南非特有藻类具有抗炎作用。同样，Kim［20］完成了对靛玉红-3-单肟（I3M）抗炎作用的研究，即通过LPS 刺激RAW264.7 细胞24 h 后复制UC 体外炎症细胞模型，发现I3M 的抗炎作用与下调NF-κB 和MAPK通路的激活相关。大黄酸的体外抗溃疡性结肠炎活性的实验，是通过减少LPS 诱导的RAW264.7 巨噬细胞中促炎细胞因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）的表达，抑制NF-κB 活化实现的［21］。Kim等［22］的研究采用Caco-2 细胞和RAW264.7 巨噬细胞共培养体系建立肠道炎症体外模型，简而言之，可记录为“Caco-2 细胞在具有半透性支持膜的6 孔细胞培养插入物中生长，将鼠RAW 264.7巨噬细胞在6 孔培养板中培养，然后将含有Caco-2 细胞的培养插入物置于6孔板中以建立共培养系统”，并认为该模型在细胞水平类似人结肠炎。

李进安等［23］将人肠黏膜组织内淋巴细胞分离，IL-12诱导其促炎因子升高，将制备好的大鼠含药脑脊液作用于人体外细胞，证实了四君子汤含药脑脊液具有抑制UC患者肠黏膜淋巴细胞的功能。还有研究通过采集受试者外周血淋巴细胞培养［24］，给予刺激物和药物干预的方式，探讨黄芩苷的体外免疫调节作用。董文毅等［25］也是通过分离人外周血淋巴细胞/单核细胞，经细胞培养与人肠道厌氧菌抗原刺激后，加入中药煎剂，检测调节性T 细胞分化情况，并筛选出黄芪、丹参为UC组方的首选中药。

2 UC模型致炎致损剂的选择

LPS是目前体外复制UC模型使用最为广泛的致炎剂之一。当LPS信号传入细胞后，可以通过细胞内信号传递，发生级联反应，使基因表达发生变化，诱导多种促炎因子（如TNF-α、IL-1、IL-6等）的合成及释放［26-27］。董旭旸［28］通过对人结直肠腺癌细胞系DLD-1 体外实验探讨基质Gla 蛋白在UC 发病中的作用，证实5 μg/mL 的LPS 刺激细胞24 h 后可以成功建立模型。利用LPS刺激巨噬细胞产生炎症反应是在细胞层面用来测评活性因子抗炎功效的经典模型［29］，刘丽娟等［17］和陈宇等［29］选取LPS 刺激小鼠单核巨噬细胞RAW264.7，LPS 的作用浓度和作用时间分别为10 mg/L，24 h 和1 mg/L，12 h。刘超［30］在使用浓度为0.1 mg/L的LPS刺激RAW264.7细胞24 h 后，ELISA 法测定细胞上清促炎因子的含量增多，证实模型复制成功，而一项对白芨多糖体外治疗UC的研究选用0.1 mg/L的LPS，作用时间48 h［31］。多数实验均采用1 mg/L的LPS诱导RAW264.7细胞塑造UC 体外模型［32-33］。前文所述大黄酸体外抗炎活性的研究中，LPS 刺激RAW264.7 所用的浓度亦为1 mg/L（1 μg/mL），作用时间为24 h［21］。另外，还有研究选用U937 细胞株，先经佛波酯诱导成为巨噬细胞后，再用2 mL浓度为1 μg/mL的LPS刺激，结果提示白术黄芪汤具有体外抗炎作用［34］。KE 等［35］为了进一步阐明清化肠饮的体外抗炎活性，用浓度为1 μg/mL的LPS刺激Caco-2细胞24 h，ELISA法测定IL-6 的含量；Western blot 法分别测定LPS（1 μg/mL）刺激30 min后，Caco-2细胞的p-STAT3、p-JAK1/2和24 h 后的SOCS3 的表达，评价其对UC 细胞模型中IL-6/STAT3/SOCS3信号通路的影响。

其他常用的致炎剂还包括肿瘤坏死因子、干扰素、白细胞介素等。研究发现，干扰素-γ（INF-γ）或TNF-α预处理后的肠上皮细胞增强LPS诱导产生的促炎细胞因子［36］，赵青春等［8］、沈洪等［13］的课题组以TNF-α、LPS 共同刺激诱导HT-29 细胞炎症模型，使用hTNF-α（20 ng/mL）孵育12 h 后，再给予LPS（1 μg/mL）孵育15 h 来建立UC 模型组。王春赛尔［37］选取了1 株结肠正常上皮细胞（CCC-HIE-2 细胞）和2 株结肠癌细胞（Caco-2、HCT-116 细胞），对UC 及其癌变展开研究，确定了IL-6和TNF-α 的最佳刺激浓度及时间均为50 ng/mL，6 h。亦有报道称白细胞介素-1β（IL-1β）对Caco-2细胞系的激活作用强于TNF-α 和LPS，可以用来复制肠上皮炎症细胞模型［38-39］。

除上述所列举的常用致炎剂以外，过氧化氢（H2O2）也被用作UC体外模型的刺激物。Wang等［40］选用浓度为200 μl/L 的H2O2刺激鼠肠上皮IEC-6 细胞4 h，观察药物抑制H2O2诱导IEC-6 细胞凋亡和caspase-3活化的过程。此外，张涵等［41］采用三硝基苯磺酸对大鼠进行灌胃复制UC模型，3 d后取血分离血清作为损伤剂，用于Caco-2 细胞模拟UC 炎症损伤细胞模型。

3 UC炎症模型建立的检测指标

目前，对UC 体外细胞模型建立的评价多是从确认促炎因子的表达升高入手，常用的指标有IL-1（IL-1β）、IL-6、IL-8、TNF-α、INF-γ 等。研究发现UC患者体内存在多种促炎细胞因子水平的增加，并与UC 的发病相关，故对体外模型促炎因子表达水平的测定，也是在UC发病理论指导下，基于尽可能复制体内环境进行的［42-45］。正如一项研究通过LPS诱导RAW264.7 细胞构建UC 体外炎症模型［46］，就是以IL-6/TNF-α指标评价模型的建立，探讨靛蓝的体外抗炎活性的。