王 丽，赵 锐，张秋芳

（淄博市食品药品检验研究院，山东 淄博 255000）

我国中药材资源丰富，有12 000余种，不同地区用药差异明显，导致药材来源复杂、品种多变，严重影响了中药临床用药的疗效及稳定性。为保证中药在临床用药中安全有效，中药材的鉴定已成为中药研究中的重要内容。原植物（原动物）鉴定、显微鉴定、性状鉴定、理化鉴定等方法是较为常用的中药材鉴定方法。但这些鉴定技术较易受生长环境、储存、加工工艺及鉴定人员的主观性等方面的影响。DNA条形码等现代生物技术的发展，弥补了传统鉴定方式准确度低、主观性较强等缺陷，大大提高了中药材鉴定的效率及准确性，在中药材的质量控制方面有非常广阔的应用前景。

1 常见分子技术及应用现状

限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析被称为第一代分子标记技术，是通过分析酶切片段的长度差异来进行基因型差异分析的一种分子生物学手段，其特点是共显性，能鉴别出纯合与杂合基因型，且稳定性好、重复性强。该方法的缺点是在鉴定不同物种时需选择与其相对应的探针，技术难度较大。此项技术在川贝母[1]，天麻[2]，白茅根[3]等植物类中药材的基原鉴定、资源种类分析方面已有相关研究。随机扩增多态DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）分析属于指纹图谱类技术，该技术无需对植物进行任何分子生物学探究，直接通过随机引物进行扩增，得到多条不同分子量的谱带，比较样本间的差异便可做出物种鉴别。该方法的不足之处为稳定性不强，重复率不够高。该方法在竹节参[4]、广藿香[5]、黄精[6]等常见的中药材鉴定中应用较为广泛。扩增片段长度多态性（amplication fragment length polymorphism，AFLP）分析是一种结合RFLP和PCR的指纹图谱技术，其优点是无需事先合成引物或设计探针，且由于该技术对引物退火温度有极高的要求，因此具有高重复性、高分辨率等优点，但该技术需要研究者有较高的理论知识和实验技能，且费用相对较高。近期该技术应用于益智[7]、党参[8]及粗茎秦艽[9]等中药材的鉴定和种内遗传多样性的分析研究工作。微卫星即简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）技术和在其基础上发展起来的简单序列重复区间（inter-simple sequence repeat，ISSR）标记分析可鉴定不同物种、同一物种的不同位点及同一位点不同等位基因之间的差异，可揭示更多的多态性。研究报道该技术可应用于温莪术[10]、金银花[11]、黄芪[12]等植物的药用研究及资源评价方面。缺点是其操作过程相对复杂，引物通用性较差，针对不同引物、不同材料使用的扩增条件差异较大，需对反应体系及条件反复摸索。

DNA条形码技术作为新兴的分子检测技术有着其他检测技术无法比拟的优势。该技术只需选用一个或几个简短的基因片段就可对整个属、科甚至多个科的绝大多数物种进行鉴定。其操作更易实现自动化，鉴定过程相对于其他分子方法更快速。可利用互联网等信息平台对鉴定结果进行全球化统一管理及共享等。

2 DNA条形码技术在动、植物中药材鉴定中的应用

2.1 DNA条形码技术简述及鉴定流程

DNA条形码技术是利用生物体内能代表该物

种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段来进行物种身份确认的生物技术。DNA条形码概念在2003年由加拿大动物学家Paul Hebert首次提出，之后受到广泛关注，利用该技术可进行物种间的快速自动鉴定。此项技术的主要操作及分析流程为：（1）对中药材进行预处理；（2）DNA提取；（3）PCR扩增；（4）PCR产物检测与纯化；（5）序列测定及质量评估。

2.2 DNA条形码在植物类中药材鉴定中的应用

2.2.1 ITS/ITS2序列与植物类中药材鉴定 内部转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）序列存在于核糖体RNA，为核糖体RNA内部转录间隔区序列，该序列种属特异性明显，保守性强，易扩增且具有足够的可变性以区分密切相关的物种。Kress等[13]选取了10个常见条形码，通过对7个科相关物种及53个科88个属99个物种的鉴定，证实了ITS可用于鉴定属间、种间、居群间等相对低分类等级的系统关系。朱英杰等[14]分别选择psbA-trnH、叶绿体核酮糖-1, 5-二磷酸羧化酶大亚基（rbcL）、matK、rpoB、rpoC1及核ITS2序列作为DNA条形码对重楼属11个物种进行鉴定，发现ITS2的扩增和测序效率均达100 %。借助ITS2序列能方便快捷地鉴定出大多数全草类中药，如大青叶[15]、砂仁[16]、党参[17]等。

2.2.2psbA-trnH序列与植物类中药材鉴定psbA-trnH序列是被子植物叶绿体基因psbA与trnH之间的一段非编码区，该区域进化速度快，变异位点多，常用于植物属间、种间的系统发育研究。Sun等[18]选择psbA-trnH序列作为研究对象，对忍冬及其相关物种共44个样本进行检测，其成功率高达100 %。有研究表明该条形码可精准、高效地鉴定枸杞属植物、薯蓣属、何首乌等各基原及其近缘物种[19-21]。由于psbA-trnH序列的测序成功率较高，该序列与其他序列组合作为DNA条形码也能提高植物类药材鉴定的准确性与时效性。psbA-trnH与trnL-F形成组合序列可有效鉴别黑胡麻与多叶胡麻。psbA-trnH与matK、trnL-F形成组合序列可有效鉴别野菊与药用野菊。

2.2.3 其他常用序列与植物类中药材鉴定matK也是叶绿体基因中变化较大、进化速度较快的序列，能在种属水平上提供更多的进化与发育信息，单独或与其他序列组合均适用于植物类中药材的分子鉴定。刘静等[22]选择matK序列作为DNA条形码，快速、精准地鉴定出了石斛属12个物种的基原。研究发现该条形码在白头翁、高良姜、鸡血藤与其混伪品的鉴定中都发挥了极大作用[23-25]。matK与psbA-trnH序列在豆蔻科中有显著的差异，利用两种条形码组合对该科10个种的40个样品进行鉴定，有效率达95 %。rbcL序列同样属于叶绿体基因序列，该序列变异信息丰富，也是较为常用的中药材鉴别条形码。Newmaster等[26]对GenBank中rbcL序列进行了详细分析，研究发现其可鉴定出同属物种的85 %，当该序列与psbA-trnH序列组合测定时，对43科48属96种的鉴定效率甚至能达到88 %。国际生命条形码协会植物工作组也早已将rbcL和matK序列组合作为植物的条形码序列。在我国基于rbcL序列的条形码鉴定也已在浙贝母[27]、阳春砂[28]、红景天[29]等中药材鉴定中得到广泛应用。

2.3 DNA条形码在动物类中药材鉴定中的应用

2.3.1 线粒体细胞色素C氧化酶亚基I（COI）序列与动物类中药材鉴定COI序列是一段长约650 bp的线粒体基因，该序列极易利用通用引物进行扩增，同时又能保证足够变异，其序列中几乎不存在插入和缺失。利用COI序列对金钱百花蛇及其混伪品共4个种11份样品进行分析，相同的属能明显聚集在一起，且各物种又形成相对独立的支，能与伪品明确区分开，该方法已被《中国药典》[30]收载。杜鹤等[31]对鳖甲及其伪品8个种15份样品的COI序列进行研究，NJ树显示，5个正品样本能明显地聚集在一起，与伪品区分度较高。近年，基与COI序列的DNA条形码，已广泛应用于熊胆粉[32]、蛤蟆油[33]、鹿茸粉[34]等名贵中药材的鉴别。

2.3.2 线粒体细胞色素b基因（Cytb）序列与动物类中药材鉴定Cytb序列属于线粒体基因，是一段具有丰富系统发育信息的较短DNA片段，所包含的遗传信息适用于种间、属间鉴定。罗晖明等[35]发现阿胶中驴源性物质的Cytb基因可被酶切成长度为76 bp与314 bp的两个片段，伪品无此酶切反应，为其质量控制提供了可靠的技术保障。王义权等[36]通过Cytb基因序列研究成功鉴定了金钱白花蛇、乌梢蛇等蛇类中药材。另外，利用Cytb基因序列也可灵敏、准确、高效地鉴定出燕窝[37]、林蛙油[38]、穿山甲[39]等药材与营养品中掺伪现象。

2.3.3 rRNA条形码与动物类中药材鉴定 rRNA即核糖体RNA，在细胞内含量较多，其相对分子质量也较大，能在mRNA的指导下将氨基酸合成肽链。现有较多的研究表明，rRNA序列条形码适用于多种动物类中药材的鉴定。刘忠权等[40]对中药材龟甲与其混伪品18个种进行线粒体12SrRNA基因序列测定，成功鉴别出所有伪品。白根本等[41]对11种鹿的鹿血与鹿茸进行特异性PCR扩增，利用通用引物L1091和H1478扩增细胞线粒体12SrRNA基因片段，准确区分出具有差异的种。12SrRNA基因片段也能快速、高效地鉴定出蛤蟆油[42]、塞隆骨[43]、乌贼[44]等动物类中药材与其掺伪品。有些动物类中药材可通过多种条形码进行鉴别与鉴定，但不同的条形码之间鉴定的准确性与灵敏度存在一定差异。

3 DNA条形码等分子鉴定技术在中药材鉴定中存在的问题

DNA条形码等分子鉴定技术在中药材鉴定方面比传统鉴定方法有明显的优势，当然也存在一定的局限性。目前，条形码选择、DNA提取、序列测定等分子生物学方法在中药材鉴定方面缺少相关标准，形成分子鉴定技术标准规范及确定对照序列或条形码可减少其操作盲目性，也为实验室之间的数据比对提供可靠依据。虽然现阶段在2020年版《中国药典》中已有对乌梢蛇、蕲蛇、川贝母、金钱白花蛇、霍山石斛的法定DNA分子鉴别方法，但相对于《中国药典》所列的500多种常用动植物药材来说数量还是极少的，仍需寻找特异的DNA分子探针，继续完善相关品种的基因序列与条形码。DNA条形码等分子技术目前在动植物类药材真伪鉴定中发挥了极大的作用，但从根本上评估中药材的质量仍有一定难度，如利用该技术很难区分出中药材具体用药部位；对于存储、运输条件不当，已发生霉变、褐变或由于放置时间过长，已出现大量细胞衰亡及DNA降解的中药材，无法利用以上技术对指定的DNA片段进行扩增，也会大大限制其应用，只能结合传统方式来对药材来源及药用部位进行准确、全面的鉴定。

4 小结

DNA条形码等分子鉴定技术借助其操作简单、便捷，结果准确、有效等优势，逐渐被广泛应用于中药材鉴定工作中。借助此技术对正品道地产地药材与非道地药材进行对比分析，搞清其遗传结构与分化水平，可为该药材的鉴别、良种选育、种质资源的利用提供遗传资料。该技术的引入能在一定程度上缓解鉴定人才缺乏的现状。可利用某一种药材的DNA条形码，并结合该药材的产区、种植基地、生长年限、采收年份等信息，按设定的编码规则编译成二维码。这种方式能提高对中药材生产及流通管理的有效性，使中药材质量控制体系不断完善。