罗干，倪吉祥，徐彪，谈华栋

三峡大学人民医院 宜昌市第一人民医院呼吸与危重症医学科，湖北宜昌443000

肺纤维化是一种进行性发展且致命的疾病，受遗传、环境、衰老表观遗传变化相互作用影响，导致肺泡上皮细胞（AEC）损伤，从而引发AEC 异常活化。活化的上皮细胞分泌大量细胞因子，如转化生长因子β（TGF-β），从而促进成纤维细胞迁移和增殖，并使成纤维细胞分化为肌成纤维细胞。肌成纤维细胞分泌大量细胞胶原蛋白，从而导致胶原蛋白进一步沉积。在损伤修复阶段，激活细胞凋亡途径和巨噬细胞的吞噬作用，可恢复内环境的稳态。在肺纤维化中存在一种严密调控的非凋亡性但具有坏死形态特征的新细胞死亡方式，此过程被称为调节性细胞坏死。调节性细胞坏死包括细胞程序性坏死、细胞焦亡、细胞铁死亡等。现将几种常见的调节性坏死方式涉及的信号通路及其在肺纤维化中的作用机制综述如下。

1 细胞程序性坏死与肺纤维化的关系

1.1 细胞程序性坏死 细胞程序性坏死是一种受死亡受体以及Toll样受体的配体和某些病原体调控的促炎症性反应，但不依赖半胱氨酸天冬氨酸坏死细胞的死亡形式。这种细胞死亡过程依赖于受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸激酶1（RIPK1），并且可被程序性坏死抑制素-1（nec-1）抑制［1］。随着研究深入，程序性坏死被定义为由RIPK1、丝氨酸/苏氨酸激酶3（RIPK3）、混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL）三者相互介导，如在小鼠巨细胞病毒感染、一氧化氮诱导的胰腺β细胞死亡和成纤维细胞死亡中发现混合谱系激酶结构域样假激酶（MLKL）作为细胞程序性坏死的效应器，进一步增强了这一效应表达［2-3］。最具有特征性的程序性坏死形式由肿瘤坏死因子α（TNF-α）引发，也可由TNF-α死亡配体家族的其他成员引发，如死亡因子配体和TNF 相关凋亡诱导配体以及干扰素、Toll 受体信号和通过Z 型DNA 结合蛋白1 的病毒感染诱导［4］。在典型的坏死途径中，TNF-α 与其受体肿瘤坏死因子1 型受体（TNFR1）结合并将其激活，促进TNF 受体相关死亡域结合蛋白的募集（TRADD）。TRADD 通过其细胞内DD 结构域与TNFR1 的细胞内死亡结构域结合，并招募TNF 受体相关因子蛋白、细胞凋亡抑制剂蛋白、线性泛素组装复合物、RIPK1、血红素氧化IRP2泛素连接酶1L（HOIL-1L）、HOIL-1L 相互作用蛋白，共同形成TNFR复合物Ⅰ并诱导核因子-κB（NF-κB）信号传导［5］。圆柱瘤蛋白是一种导致TNFR 复合物Ⅰ失去稳态的去泛素化酶，可导致TNFR复合物Ⅰ与胞浆中的受体分离，并通过形成两种类型的TNFR复合物Ⅱ促进细胞死亡。虽然信号传导在凋亡和程序性坏死之间相互作用，但最终信号传导依赖于半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶8（Caspase-8）。当TNFR复合物Ⅱa形成时，死亡因子相关死亡域和Caspase-8被组装以诱导细胞发生凋亡。相反，当TNFR 复合物Ⅱa 中的Caspase-8 激活受损时，TNFR 复合物Ⅱb（即坏死小体）形成，RIPK1 通过RIPK3 募集和激活启动程序性坏死［6］。参与RIPK3 激活的信号通路涉及RIP 同型相互作用基序（RHIM）域的受体、适配器和激酶的同型相互作用。RIPK1 和RIPK3 的RHIM结构域启动细胞程序性坏死，介导坏死小体的淀粉样信号复合物形成，这一过程由热休克蛋90 和细胞分裂周期37辅助完成［7］。一旦坏死小体形成，RIPK3磷酸化，导致MLKL自身磷酸化寡聚并转移到细胞膜上，形成质膜孔，使细胞破裂及细胞膜通透性增强，细胞内物质释放，形成损伤相关分子模式（DAMP），经典DAMP包括热休克蛋白（HSP）、促进炎症的高迁移率族蛋白B1（HMGB1）、S100蛋白家族［5，8］。

1.2 细胞程序性坏死在肺纤维化中的作用 肺纤维化的病理特征为AEC 损伤，导致伤口愈合失调，促炎性应激反应，从而导致肌成纤维细胞分化和肺间质中异常的胶原沉积。过去认为上皮细胞凋亡是肺纤维化发病机制中调节性坏死的主要形式。然而有关研究在TUNEL分析中检测到肺泡上皮细胞存在非凋亡DNA片段，表明TUNEL阳性细胞不仅包括凋亡细胞，还包括坏死细胞。损伤后的上皮细胞向细胞外空间释放趋化因子和DAMP、热休克蛋白和白细胞介素［9］。DAMP 可以激活邻近上皮细胞和免疫细胞上的模式识别受体，直接刺激促纤维化细胞因子释放，进而参与成纤维细胞激活。上皮细胞还分泌促炎性细胞因子，这些细胞因子相互聚集并激活适应性免疫细胞（T淋巴细胞、B淋巴细胞），进一步分泌促纤维化因子（IL-33、IL-4、IL-5、IL-13）。据报道，体外受损上皮细胞释放的HMGB1 导致IL-1β 水平上调，进而激活TGF-β1，促进AEC间质转化［10］。LI等［11］证明HMGB1可以通过激活TGF-β1/Smad2信号通路介导气道上皮细胞的上皮间质转化（EMT）。WANG等［12］随后证明，HMGB1诱导的TGF-β1释放先于肺成纤维细胞中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和Ⅰ型胶原蛋白（COL1）表达上调。总之，以上研究表明，受损上皮细胞释放的HMGB1可能通过持续上调TGF-β1，导致成纤维细胞活化、分化和胶原蛋白沉积，从而促进纤维化的发展。尤其是在AEC 中，观察到RIPK3 和磷酸化的MLKL 在内的坏死性标志物表达显著高于健康对照组［13］。同样观察到，在博来霉素（BLM）诱导小鼠的AEC 中RIPK3、磷酸化的MLKL 表达上调，并释放HMGB1 和IL-1β；且在RIPK3 基因敲除小鼠模型中得以证实，在BLM 诱导下，细胞炎症化和纤维化的表达均减弱［11，13］。这表明细胞程序性坏死有助于纤维化的发展，且能被nec-1有效抑制。表明细胞程序性坏死释放的DAMP通过调节炎症和肌成纤维细胞的积聚，对肺纤维化的发病机制进行调控。

2 细胞焦亡与肺纤维化的关系

2.1 细胞焦亡 细胞焦亡是调节性细胞坏死一种新的途径，一种不同于细胞凋亡的死亡方式，发生在实质及非实质细胞间，涉及细胞肿胀破裂、渗透溶解和细胞内容物（IL-1β、IL-18、HMGB1）的释放，且伴有细胞器变形、DNA 断裂和核浓缩，从而导致炎症反应［14］。细胞焦亡最初被认为只是半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶1（Caspase-1）介导的细胞死亡。随着研究的深入，发现Caspase-3、4、5、8 和11 也能介导细胞焦亡［15］。经典的细胞焦亡信号调节，通过模式识别受体和炎症小体蛋白复合物介导微生物产物激活Caspase-1。最具广泛特征性炎症小体家族是NLRP3 炎症小体的NOD 样受体结构域，由NLRP3、NLR 家族的细胞溶质传感器、衔接分子凋亡相关斑点样蛋白和激活的Caspase-1 组成。炎症小体的组装始于细胞溶质模式识别受体（包括炎症小体传感器），能够识别DAMP 和危险相关分子模式，后者是细胞应激的次级产物［16］。炎症小体的激活需要两步激活和启动信号。启动信号由TLR 配体或干扰素信号介导，并通过活化NF-κB 诱导某些炎症小体成分的转录。炎症小体组装后，Caspase-1 被激活，并水解成2 个片段，形成一个二聚体。一方面，Caspase-1在Asp275位点切割碱性执行蛋白GSDMD，形成C 末端（GSDMD-C）和N 末端（GSDMD-N）。GSDMD-N 能穿透细胞膜，形成内径10～14 nm 的非选择性孔，导致细胞肿胀［17］。另一方面，Caspase-1 分解促炎细胞因子IL-1β、IL-18 的前体，这些前体通过GSDMD 形成的孔释放来增加细胞膜通透性，包括IL-1β、IL-18 在内的细胞质内容物渗出，进一步触发细胞焦亡［18］。非经典途径由Caspase-4、-5、-11介导，其中Caspase-4、-5 存在于人类中，Caspase-11 存在于小鼠中。该途径由脂多糖（LPS）直接激活，激活后的Caspase-4、-5、-11诱导细胞溶质蛋白GSDMD分裂为GSDMD-N 和GSDMD-C。N 末端片段在细胞膜内寡聚形成热解孔，导致细胞的通透性屏障破坏，K+外流，诱导NLRP3 炎性小体组装，最终导致细胞焦亡［19］。但研究发现，细胞膜半通道蛋白（Pannexin-1）是另一个关键蛋白，在Caspase-11 诱导的非经典途径中介导细胞焦亡。在LPS 刺激下，激活的Caspase-11 可以特异性剪切和修饰Pannexin-1，导致细胞释放ATP，从而诱导通过离子通道P2X7受体介导的细胞死亡［20］。

2.2 细胞焦亡在肺纤维化中的作用 有研究表明，在矽肺、肺纤维化引起的肺损伤中，Caspase-1、NLRP3、IL-1β、IL-18 和GSDM 家族蛋白都与患者的纤维化发展呈正相关［21］。TGF-β是一种主要的促纤维化细胞因子，Caspase-1、NLRP3 和NF-κB 已被确定为TGF-β/SMAD 轴的重要上游激活剂［22］。由于细胞焦亡是纤维化的关键部分，因此对抗细胞焦亡可以作为抗纤维化治疗的新靶点。HUSSAIN 等［23］将原代人支气管上皮样细胞（HBE 细胞）充分暴露于多壁碳纳米管中，后将人胚肺成纤维细胞（MRC-5）以多壁碳纳米管时间-剂量方式培养于HBE 细胞稀释后的培养基中。经过一段时间处理后，促纤维化标志物的mRNA 表达显著增加，但TGF-β 表达并无变化。但当条件培养基中添加IL-1β、IL-11 中和抗体或使用NLRP3 小干扰RNA 转染HBE 细胞的条件培养基后，促纤维化标志物表达显著降低。这说明上皮细胞中NLRP3 炎性小体激活是MRC-5 细胞促纤维化基因表达的关键介质。另外，LIANG 等［24］通过观察石蒜碱（LYC）对BLM 诱导的肺纤维化小鼠模型和NLRP3炎症小体激活，发现LYC在BLM诱导的小鼠急性肺损伤期间能抑制活性Caspase-1 表达和乳酸脱氢酶释放。并且体外试验表明，LYC 抑制LPS/ATP 诱导的NLRP3 炎症小体激活及骨髓源性巨噬细胞焦亡。LYC 可通过靶向pyrin 结构域（PYD）来干扰NLRP3与凋亡相关微粒蛋白（ASC）的相互作用。结果表明，LYC 的保护作用依赖于通过靶向ASC 的PYD 结构域来抑制NLRP3 炎症小体激活和细胞焦亡，从而改善BLM 诱导的肺纤维化。LI等［25］研究表明，二氧化硅持续激活NLRP3 炎症小体，并且IL-1β 和IL-18 的细胞外表达水平持续升高。并通过短发夹RNA介导NLRP3表达下调，抑制了细胞焦亡。使用NLRP3选择性抑制剂MCC950和Caspase-1 抑制剂Z-YVAD-FMK 能降低二氧化硅诱导的炎症细胞数量及α-SMA 的表达。并通过分析表明，TKA1-MAPK/NF-κB 通路参与了NLRP3 炎症小体介导的EMT。上述研究表明，通过下调NLRP3表达，抑制NLRP3 炎症小体本身的激活及其效应物均可以缓解二氧化硅诱导的EMT。提示NLRP3 炎症小体通过IL-1β-TAK1 MAPK/NF-κB 途径调节二氧化硅诱导的EMT，从而诱导肺纤维化。因此，细胞焦亡是一种以炎症为特征的免疫调节反应，调节肌成纤维细胞的激活，导致细胞外基质及胶原蛋白沉积，从而导致肺纤维化。NLRP3 炎症小体参与了肺纤维化发展过程，干预NLRP3 炎症小体可改善肺纤维化发展，所以NLRP3 炎症小体未来有可能成为肺纤维化治疗的新靶点。

3 细胞铁死亡与肺纤维化的关系

3.1 细胞铁死亡 DIXON 等［26］首次将细胞铁死亡描述为一种新的调节性细胞坏死，细胞铁死亡的激活受脂质修复酶的潜在调节，脂质修复酶包括谷胱甘肽（GSH）和GSH 过氧化物酶4（GPX4）。细胞铁死亡由铁依赖性活性氧（ROS）和脂质过氧化物的过度聚集引起，其特征是线粒体膜密度增加和细胞体积缩小，线粒体嵴在形态学上不同于凋亡和坏死［27］。胱氨酸-谷氨酸反向转运体（System Xc-）调控途径系统，由催化亚单位溶质载体家族7 成员11（SLC7A11）和调节亚单位溶质载体家族3 成员2（SLC3A2）组成，该转运体是一种促进胱氨酸进入细胞的胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白，在调节细胞铁死亡中起重要作用。System Xc-介导细胞内胱氨酸和细胞外谷氨酸的交换，比例为1∶1。细胞内的胱氨酸可以转化为半胱氨酸，半胱氨酸是合成GSH 的限速底物。GSH 对细胞抗氧化防御系统很重要，可以直接与ROS/氮物种、亲电体相互作用，也可以作为各种抗氧化酶的辅助因子［27-28］。研究表明，GSH 在控制细胞铁死亡中所起的关键作用归因于GPX4 辅助因子的功能。GPX4 通过抑制细胞膜的过氧化作用保护细胞免受铁死亡的影响。细胞内游离铁和脂质过氧化物的存在都是执行细胞铁死亡的先决条件［28］。虽然通过β-巯基乙醇增加胱氨酸摄取和通过靶向激活转录因子4促进SLC7A11基因转录可以抑制细胞铁死亡，但通过其抑制剂（包括erastin、柳氮磺胺吡啶、谷氨酸）阻断System Xc-可导致胱氨酸吸收不足，GSH 消耗，抗氧化能力降低、脂质ROS 积累，从而诱导细胞铁死亡［29］。除了关键的细胞铁死亡调节途径外，多个小分子蛋白53、核因子红细胞样蛋白2 相关因子2（Nrf2）和丝裂原活化蛋白激酶均参与了细胞铁死亡的调节。

3.2 细胞铁死亡在肺纤维化中的作用 研究表明，肺纤维化患者肺中的总铁水平、铁相关氧自由基和含铁巨噬细胞较正常组均有所增加［30］。铁死亡是一种与炎症病理学有关的程序性细胞死亡。有研究发现，ROS 聚集增加和GSH 消耗与细胞铁死亡过程密切相关，在肺纤维化的发病机制中也起着关键作用［31］。放射性肺纤维化（RILF）是胸部放射治疗中一种严重的危及生命的并发症。LI 等［32］发现铁死亡促进RILF的发生发展，并且阐明ROS聚集是这一过程中细胞铁死亡的关键诱因。在RILF 小鼠模型照射组中发现，肺组织体积缩小，线粒体密度增加，嵴减少，外膜中断，这些均呈现典型的铁死亡特征，且ROS 水平上调，GPX4 水平下调。铁死亡抑制剂liproxstatin-1（Lip-1）可使RILI 小鼠肺结构损伤减轻，出血减少，线粒体收缩减少，GPX4 水平增加，胶原蛋白沉积被抑制，下调了RILF 小鼠肺内ROS 和HYP 的水平，降低了血清炎性细胞因子水平。但是RILF 小鼠中的Nrf2、血红素加氧酶-1（HO-1）和醌氧化还原酶1（NQO1）蛋白、mRNA 表达均被Lip-1 上调。因此，Lip-1 通过激活Nrf2、上调HO-1 和NQO1表达、下调TGF-β1表达、抑制肺组织细胞铁死亡来减弱RILF。另外，铁死亡与百草枯（PQ）诱导的肺损伤有关，铁死亡抑制剂有望治疗PQ中毒。在肺纤维化氧化药物和细胞寿命模型中，铁死亡激活剂erastin 降低人胎肺成纤维细胞中GPX4 的活性，并促进脂质过氧化物、α-SMA、COL1的表达，促进成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化［33］。铁死亡抑制剂Fer-1增加GPX4 表达并降低脂质过氧化物，消除TGF-β1和erastin 对细胞铁死亡的影响，抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化，延缓IPF 进程［34］。WANG等［35］研究证明，PM2.5 诱导内皮细胞会破坏细胞内铁和氧化还原平衡，进而导致内皮细胞铁死亡，并分泌炎性细胞因子。并且由铁依赖性脂质过氧化引起的PM2.5 诱导的铁死亡，可在药理学上通过脂质氧化抑制剂和铁螯合剂进行挽救。

综上所述，随着对调节性细胞坏死的进一步了解，细胞程序性坏死、细胞焦亡、细胞铁死亡区别于之前所研究的细胞凋亡及细胞坏死。通过多种细胞死亡途径来提高了对肺纤维化机制的认知。调节性细胞坏死的发生受某些免疫过程的影响，这些免疫过程中出现的调节网路可能对肺部疾病的治疗至关重要。在未来的工作中，需要深入研究肺纤维化中调节性细胞坏死通路之间的相互联系，取得肺部疾病临床治疗的历史性突破。