李廷刚，巩东营，张倩倩

（1山东省葡萄研究院，济南 250100；2山东省农业科学院农产品研究所，济南 250100）

0 引言

黄萎病是棉花生长过程中的主要病害影响棉花产量提高和品质提升，严重发生时甚至可造成绝产，因此又被称为棉花的“癌症”[1]。棉花黄萎病是一种典型的土传真菌病害，在中国主要由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)侵染所致。由于中国棉花种植结构单一、棉田连作、加之棉花种子异地调运等原因，导致黄萎病在中国各大棉区均有危害发生[2]。大丽轮枝菌变异速度快，加之棉花抗性资源匮乏，因此棉花黄萎病防治极为困难。目前选育棉花优异抗黄萎病品种是解决这一困境最为经济有效的策略，这就要求首先探索棉花抗黄萎病遗传规律，进而开展抗性QTL 定位研究，最终挖掘优异抗病基因，从而为棉花抗黄萎病遗传育种奠定基础[3]。目前，不少学者在棉花黄萎病抗性遗传规律、抗性QTL定位以及抗病基因挖掘等方面开展了研究，初步探索了棉花黄萎病的抗性遗传规律、定位了350多个抗性QTL、鉴定了50 多个抗病基因，但是仍存在棉花黄萎病抗性遗传规律不确定、抗性QTL应用性差以及抗病基因资源不足的现状[4]。棉花栽培主要以陆地棉和海岛棉为主，通常认为海岛棉是黄萎病抗性的主要来源，但也有优异抗黄萎病陆地棉种质资源的报道[5]。本研究分别对海岛棉和陆地棉抗黄萎病遗传规律、抗性QTL定位以及抗病基因挖掘现状等进行了归纳总结，以期为棉花抗黄萎病育种提供理论依据。

1 棉花黄萎病抗性遗传规律研究

Plank等[6]于1963年首次提出了抗性理论，包括垂直抗性和水平抗性两种。垂直抗性理论是指抗病基因与病原菌不同生理小种间的抗性关系是一一对应的，寄主植物对病原菌的抗病性一般由主效单基因所控制，表现为质量性状遗传。水平抗性理论则是指抗病基因与病原菌之间是一对多的关系，一个抗病基因可以对病原菌多个生理小种产生抗性，寄主植物对病原菌的抗病性通常由多个微效基因所控制，表现为数量性状遗传。数量性状遗传群体的抗性表型多呈现出连续的正态分布趋势，但是表型鉴定比较容易受到外界环境因素等的影响，但是当多个微效基因共同起作用时，也可以表现出主效基因的抗性表现，并且抗性更加稳定[7]。因此，质量性状遗传与数量性状遗传之间并没有清晰的界限[8]。Fahmy等于1931年首次报道了棉花抗黄萎病遗传方式的研究，迄今中国科研工作者也对该问题开展了多次探索，但由于试验品系、接种菌系和鉴定标准误差等原因，目前对该科研问题仍未获得确切一致的结论。

1.1 海岛棉黄萎病抗性遗传规律研究

质量性状通常由主效基因控制，主效基因控制的抗病性为显性，感病性为隐形。此外，抗性的显隐性还受品种的遗传背景、鉴定菌系和环境因素等的影响。Bell等[9]以海岛棉和陆地棉作为亲本材料，通过杂交获得7个不同组合群体，组合群体抗性鉴定结果显示，其中2个群体表现为部分显性遗传特性，5个群体表现为完全显性遗传特性，7 个组合均表现为质量性状遗传模式。马峙英等[10]以海岛棉作为亲本材料，构建了四世代和六世代遗传群体，分别使用强、弱不同致病力菌系对遗传群体进行抗病性鉴定，抗性鉴定结果显示，黄萎病抗性受单基因控制、显性模式，呈现质量性状遗传特性。房卫平等[11]以海岛棉和陆地棉作为亲本材料，通过杂交构建了4 个遗传群体，使用中等致病力菌系对遗传群体进行抗病性鉴定，抗性鉴定结果显示，黄萎病抗性同样受单基因控制、显性模式，同样呈现质量性状遗传特性。王省芬等[12]、蔡应繁等[13]也报道了与上述相似的研究结果。综合已报道研究结果表明，海岛棉黄萎病抗性主要受单个基因控制，多表现为质量性状遗传特性。

1.2 陆地棉黄萎病抗性遗传规律研究

与质量性状遗传不同，数量性状遗传由多个微效基因共同控制，多个微效基因间具有加性效应和非加性效应，其中加性效应是数量性状遗传的主要方式。已有研究报道显示，陆地棉黄萎病抗性遗传规律同时存在质量性状遗传和数量性状遗传的特征。首先，Barrow[14]以陆地棉‘Acala9519’和‘Acala227’作为亲本材料构建遗传群体，在温室中利用ss-4 菌系对遗传群体进行抗病性鉴定，抗、感分离比符合3:1 的比例，因此认为在陆地棉中黄萎病抗性符合质量性状遗传特性。蔡应繁等[14]利用多个陆地棉品种/系构建遗传群体，利用以上遗传群体开展黄萎病抗性遗传模式研究，结果显示，‘中棉所12’、‘Mo-3’的黄萎病抗性受1 对显性基因控制，而‘川2802’的黄萎病抗性受2 对显性基因控制。Wilhelm 等[15]、潘家驹等[16]研究结果也显示，陆地棉黄萎病抗性受主效基因所控制。因此认为，陆地棉中抗黄萎病遗传符合质量形状遗传特性。其次，Verhalen 等[17]以不同抗病性陆地棉为亲本构建双列杂交群体，群体抗病性鉴定结果显示，陆地棉黄萎病抗性由多个微效基因共同控制，加性效应遗传显著，符合数量性状遗传特性。王升正等[18]以陆地棉‘中植棉KV-3’和‘KV9-1 品系’为亲本构建了六世代遗传群体，群体抗病性鉴定结果显示，陆地棉黄萎病抗性受2对基因控制，且加性遗传效应显著，同样符合数量性状遗传的特性。此外，梁亚军等[7]等、Devey等[19]、王振山等[20]、校百才等[21]、韩祥铭等[22]、王红梅等[23]学者的研究报道也认为，陆地棉黄萎病抗性符合数量性状遗传的特性，同时加性遗传效应起主导作用。

对陆地棉而言，抗性遗传的方式较为复杂，通常温室单一菌系接种进行抗性鉴定，多倾向于抗性为质量性状遗传。而田间病圃进行抗性鉴定时，多倾向于抗性为数量性状遗传，且以加性效应为主。综合以上研究报道，认为陆地棉抗性遗传可能受亲本材料选择、鉴定病菌类型、鉴定条件差异和病害分级标准等因素影响较大。

2 棉花黄萎病抗性QTL定位研究

QTL定位主要基于标记间连锁发生进行，其基本原理是将分子标记与表型性状进行连锁，基于不同统计处理模型，将标记锚定到基因组的相应位置上，同时计算QTL的遗传效应[24]。目前，棉花遗传连锁图谱构建多使用SSR、RAPD、SRAP 和AFLP 等分子标记，这些分子标记因其操作简便、快捷、费用低等特点而倍受青睐，其中应用最多的是SSR 标记，房卫平等[25]、Zhu等[26]和杜威世等[27]分别利用RAPD、AFLP 和SSR 标记开展了棉花抗黄萎病QTL定位研究。

2.1 海岛棉抗黄萎病QTL定位研究

陆地棉是目前的主栽棉花品种，具有广适性特征，海岛棉作为仅次于陆地棉的第二大棉花栽培品种，具有优质的遗传基础。陆、海品种间杂交相较于种内杂交具有较高的遗传多样性，为了提高遗传图谱的密度和覆盖度，很多棉花抗黄萎病QTL 定位研究利用陆、海种间杂交构建遗传群体来开展。杜威世等[27]以‘海岛棉II15-3493’和‘陆地棉石-875’作为亲本构建遗传群体，通过定位获得1 个抗黄萎病主效QTL，可解释50.1%的表型变异。高玉千等[28]以海岛棉‘Pima-90’和陆地棉‘邯郸-208’作为亲本构建遗传群体，通过定位获得了3 个抗黄萎病主效QTLs，分别可以解释15.39%、54.11%和57.18%的表型变异。Bolek 等[29]以海岛棉‘Pima-S7’和陆地棉‘Acala-44’作为亲本构建了F2群体，基于该群体绘制了包含35 个标记覆盖531 cM的遗传连锁图谱，通过定位获得15个抗黄萎病QTLs，3 个为主效QTLs，其中cM12和STS1位于LG-1连锁群BNL3147-2位于LG-2 连锁群，由于LG-1 与LG-2连锁群都位于D基因组11号染色体上，推测该染色体为提供黄萎病抗性的主要染色体。Shi 等[30]以海岛棉‘Hai1 品系’和陆地棉‘CCRI36 品系’作为亲本构建了BC1F1，BC1S1和BC2F1群体，基于该群体绘制了包含2292个标记覆盖5115.16 cM的遗传连锁图谱，通过定位获得48 个抗黄萎病QTLs，A、D 基因组分别包含33 和15 个QTLs，其中6 个为已报道QTLs，42 个为首次发现QTLs。另外，昝伟等[31]、吴翠翠等[32]分别构建F2:3家系和永久F2群体，通过定位分别获得2和19个抗性QTLs。目前，已报道的海岛棉黄萎病抗性QTLs 已将近150个。

2.2 陆地棉抗黄萎病QTL定位研究

已有不少研究发现，棉花陆、海杂交后构建群体虽具有较高的遗传多样性，但较易出现性状分离的现象，因此，基于陆地棉优异抗性种质资源开展抗黄萎病QTL 定位研究也在不断展开。Palanga 等[33]以陆地棉作为亲本构建了RILs遗传群体，对该群体分别进行温室和田间的抗病性鉴定，基于抗性表型开展抗黄萎病QTL 定位，其中62 个QTLs 与病情指数相关，可解释3.7%～12.2%的表型变异；57个QTLs与发病率相关，可解释2.3%～21.30%的表型变异；共获得119 个QTLs，且所有QTLs 呈现簇状分布的特征，在基因组上可聚集为18 个QTL 簇。葛海燕等[34]同样以陆地棉作为亲本构建遗传群体，通过定位获得1个抗黄萎病QTL，该QTL 位于9 号染色体上，可解释13.8%的表型变异。Yang 等[35]以陆地棉‘5026’和‘李-8’作为亲本材料，构建了RIL遗传群体，基于该群体绘制了覆盖760.88cM的遗传连锁图谱，于苗期和成株期分别定位获得3 个和4 个QTLs，可解释6.39%～33.22%的表型变异。此外，李磊[36]、蒋锋等[37]、王红梅等[23]、王沛政[38]通过构建遗传群体，分别定位得到了3、3、8和41个黄萎病抗性QTLs。目前，已报道的陆地棉黄萎病抗性QTLs 共计已有200多个。

3 棉花黄萎病抗病基因研究

植物抗病基因的挖掘与抗病基因机理解析研究已有较长的时间，目前，已在水稻、玉米、小麦等多种作物中取得了显著的成果，根据抗病基因的结构域分布情况，可将抗病基因分为五大类，NBS-LRR类：包含N端螺旋卷曲结构域或Toll蛋白及白细胞介素-1受体结构域[39-40]，中间NB-ARC 结构域和C 端LRRs 结构域；LRR-TM 类：包含N 端胞外LRRs 和C 端TM 结构域；STK 类：包含STK 结构域和十四酰化位点；LRR-TMSTK 类：包含N 端LRRs 结 构域，TM 结构域 和C 端STK结构域；TM-CC类：包含TM结构域和胞内CC结构域[41]。伴随着分子生物学技术高通量测序技术的不断发展与更新，为广大科研工作者提供了更高质量的棉花基因组和更快捷的基因挖掘方案。目前，棉花中克隆的抗黄萎病基因已有几十个之多，虽取得了一定的成绩，但还远不足以克服黄萎病的危害，现对已克隆的棉花抗黄萎病基因进行归纳总结。

3.1 NBS-LRR类抗黄萎病基因

目前已挖掘的抗病基因中，NBS-LRR类抗病基因是其中最大的一类，也是研究的最为深入透彻的一类，在棉花中也有发现该类抗黄萎病基因的报道。Yang等[42]基于cDNA 文库筛选得到候选基因片段，采用RACE 策略克隆得到GbRVd基因，该基因为典型的CC-NBS-LRR类抗病基因；表达模式分析显示，GbRVd基因在棉花多个组织中均有表达，但以在叶片中表达量最高；GbRVd基因在大丽轮枝菌胁迫条件下能够显著上调表达，48 h 表达量达到最高；VIGS 沉默GbRVd基因后，棉花沉默株系中SA、NO 和H2O2的产生量显著降低，从而导致棉花沉默株系对大丽轮枝菌抗病性显著降低。Li等[43]基于海岛棉自然群体通过定位获得1 个主效抗性位点VdRL08，位点解析后发现，该位点范围内存在8 个NBS-LRR 基因，VIGS 分别沉默位点内候选基因，发现GbaNA1基因沉默株系对大丽轮枝菌抗性显著降低，同时GbaNA1基因在拟南芥中过量表达能够提高拟南芥对大丽轮枝菌的抗性水平；GbaNA1基因不同棉花品种多态性分析显示，在感病品种中该基因单碱基的缺失导致了提前的截短，从而导致丧失了黄萎病抗性；此外，还发现GbaNA1基因行使抗病功能不依赖Ave1识别途径。

3.2 STK类抗黄萎病基因

STK 类抗病基因介导抗病功能主要通过磷酸化介导抗病信号的级联放大，最终激活下游功能基因，从而抵御病原菌的侵染，达到抗病的功能。目前，STK类抗病基因的研究主要集中在模式植物拟南芥中，棉花中该类抗病基因的研究还相对滞后。Zhang等[44]在海岛棉‘Pima90-53’中克隆了1 个STK 类抗病基因GbSTK，该基因可被大丽轮枝菌诱导显著上调表达；拟南芥GbSTK基因过表达株系可诱导PR4、PR5和EREBP等抗病相关基因表达，同时提升活性氧清除能力，从而介导对大丽轮枝菌的抗病性。Zhao等[45]在海岛棉‘H7124’中克隆了1 个STK 类抗病基因GbRLK；将该基因在棉花和拟南芥中过表达，显著提高过表达株系的黄萎病抗性水平；转录组分析显示，GbRLK基因主要调控胁迫通路上相关基因，因此认为GbRLK基因主要通过减少水分损耗来赋予寄主黄萎病抗性。Gao等[46]在陆地棉‘CA4002’品系中克隆了1个STK类抗病基因GhBAK1，在CA4002 品系中VIGS 沉默GhBAK1基因后可诱导程序性细胞死亡和ROS 爆发，从而导致VIGS沉默株系黄萎病抗性水平显著降低。

3.3 LRR-TM类抗黄萎病基因

目前研究最为清晰的LRR-TM 类抗病基因为番茄中抗黄萎病基因Ve1[47]，在棉花中LRR-TM类抗病基因的研究多是基于Ve基因的同源克隆展开。Chen等[48]在海岛棉‘H7124’中克隆了1 个Ve同源基因Gbvdr3，该基因VIGS 沉默株系对大丽轮枝菌抗性水平显著降低；Gbvdr3基因在拟南芥中过表达可诱导PR1、PR3、PR5、PDF1.2和GST2等抗病相关基因的表达，同时激活活性氧的爆发和胼胝质的沉积，从而介导拟南芥过表达株系黄萎病抗性。Chen 等[49]在海岛棉‘H7124’中克隆2 个Ve同源基因GbaVd1和GbaVd2，分别将以上2个基因在棉花中VIGS沉默后，均导致沉默株系对大丽轮枝菌的抗性降低；GbaVd1和GbaVd2基因拟南芥过表达株系与拟南芥野生型转录组比对分析显示，GbaVd1和GbaVd2基因主要通过激活细胞胞吞作用、抗病信号转导以及细胞壁增厚等过程介导拟南芥对大丽轮枝菌的抗病性。此外，Zhang 等[50]、Zhang 等[51]分别在海岛棉中克隆了Ve同源基因基因GbVe和Gbve1，以上2 个基因在大丽轮枝菌胁迫条件下可被显著诱导表达，在拟南芥中过表达均能够显著提高对大丽轮枝菌的抗性水平。

目前已发现的棉花抗黄萎病基因除了以上3类以外，还有多个其他类型的抗黄萎病基因被挖掘和报道。比如，Mo 等[52]鉴定、克隆了1 个多胺氧化酶基因GhPAO，该基因可诱导精胺(Spm)高水平表达，Spm 则激活蛋白激酶和细胞色素P450的表达促进抗毒素的积累，从而提高寄主对大丽轮枝菌的抗性水平。Gao等[53]鉴定、克隆了1个棉酚合成关键基因GbCAD1和1个水杨酸调控关键基因GbSSI2，以上2 个基因均可提高棉花对大丽轮枝菌的抗性水平。Li 等[54]鉴定、克隆了一个硫氧还蛋白GbNRX1，GbNRX1基因在原生质体中可通过ROS 累积从而抵御大丽轮枝菌的侵染。此外，已报道的棉花抗黄萎病基因还包括GbTLP1、GbSTB1、GhHb1、GhSKIP35、GhPGIP1、GhDHS1、GaRPL18、GhNDR1等[55-62]，这些基因大多编码功能性酶类或者受体蛋白类，通过SA或者JA/ET途径介导其黄萎病抗性功能。

4 问题及展望

近年来，中国棉花黄萎病的发生呈现出逐年加重的趋势，有必要引起足够的重视。主要存在的问题有3个：第一，虽然对棉花黄萎病抗性遗传规律的研究已有较长的历史，但以往对于棉花黄萎病抗性遗传规律的探究多基于单一分离群体在某一特定时期的抗性表现展开，因此不能反映出棉花整个生育期的抗性情况，且可重复性差，导致目前仍无明确、一致的结论。第二，目前虽已定位到了多个棉花黄萎病抗性QTL，但是由于桥梁标记少，很多抗性QTL不能定位到棉花基因组上，应用性较差，尚不能满足实际育种的需求。第三，中国棉花种质资源大约有5000 份，植棉区主要以种植陆地棉为主，但陆地棉中高抗黄萎病资源匮乏，并且抗性稳定性较差，加之大丽轮枝菌变异速度快，导致陆地棉优异抗性资源不断消失，严重制约棉花抗黄萎病遗传改良工作的不断发展。

基于目前的研究现状，提出一下3 点建议：第一，为了获取优异的抗性种质资源，有必要挖掘优异的野生种进行驯化，或通过多种诱变手段创制新种质，或通过分子生物学技术和方法培育优异抗性品系。第二，有必要在开展棉花黄萎病抗性遗传规律研究时构建多样化、高多态性的遗传群体，同时采用更为适宜的抗性鉴定方法、寄主材料以及病原菌菌系等。第三，伴随着分子生物学技术的不断发展，分子标记辅助选择育种可以极大的提高定位精准度，缩短育种年限，同时还能克服棉花不同品种种间远源杂交不亲和的瓶颈，因此可以将分子标记辅助选择育种技术最大程度的应用于棉花抗黄萎病育种过程中，从而更好的满足棉花抗黄萎病遗传育种的现实需求和克服育种技术壁垒，加快育种进程。

目前，棉花抗黄萎病育种已经取得了显著的成果，相信持续创制优异抗性种质资源，深入揭示棉花抗黄萎病的遗传规律，伴随生物学技术的不断发展不断探索优化育种方法，必然会极大推动棉花抗黄萎病研究取得实质性的进展，最大限度降低黄萎病对棉花生产所造成的危害。