王珍，李潆，吕海江，王露，郑博，李亚静

年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）作为一种复杂多因素的视网膜变性疾病，是目前临床上老年人致盲的主要病因[1-2]。越来越多的研究[3-4]发现，由受体相互作用蛋白激酶1（receptor-interacting protein kinase 1，RIPK1）、受体相互作用蛋白激酶3（receptorinteracting protein kinase 3，RIPK3）和混合系列蛋白激酶结构域样蛋白（mixed lineage kinase domainlike，MLKL）所构成的RIPK1/RIPK3/MLKL 信号通路，可能通过介导视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞的坏死性凋亡在干性年龄相关性黄斑变性（dry age-related macular degeneration，dAMD）中发挥作用[5-6]。黄芩苷是中药黄芩的主要活性成分，具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗氧化等多种作用[7-8]，可通过多种途径抑制RPE 细胞的损伤凋亡，进而保护RPE 细胞[9-10]。但是，黄芩苷在保护RPE细胞以及对dAMD起到积极干预作用的具体机制错综复杂，本实验以RIPK1/RIPK3/MLKL 信号通路为研究切入点，明确该信号通路参与RPE 细胞的坏死性凋亡以及黄芩苷对RPE 细胞的调控作用，报道如下。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂与仪器

RPE 细 胞ARPE-19（美 国American Tissue Culture Collection 公司），细胞计数试剂-8（cell counting kit-8，CCK-8）试剂盒、4'6-二脒基-2-苯基吲哚（4'6-Diamidino-2-Phenylindole，DAPI，中国上海碧云天生物技术研究所，C0037、C1002），胎牛血清（美国犹他州大学，SH30070.03），黄芩苷（中国Selleck生物科技有限公司，S2269），蛋白印迹膜再生液（北京佰奥莱博生物科技有限公司，ZN1923），RIPK1抗体、RIPK3抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体、山羊抗兔IgG 抗体（艾博抗贸易有限公司，ab300617、ab226297、ab8245、ab205718），高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）抗体（美国Cell Signaling Technology公司，6893）。

水套式CO2培养箱（赛默飞世尔科技公司，Forma 3111），超净化工作台（苏州净化设备有限公司，SW-CJ-2FD），微孔板式多功能酶标仪（德国伯托公司，LB941），Western Blot 系统（伯乐生命医学产品有限公司，转印槽：Trans-Blot；电泳槽：Criterion™）。

1.2 细胞培养

标准培养条件下，在含有青霉素（浓度为100 U/mL）、链霉素（浓度为100 µg/mL）、10%胎牛血清的培养基中培养ARPE-19 细胞，在37℃含5%CO2和95%湿度的空气中孵育。当细胞融合至85%时，弃去旧培养基，洗涤消化后收集细胞。离心后以1∶3 的比例进行传代，2 d 进行1 次换液，稳定传代后取2～4 代用于实验。

1.3 分组与处理

将ARPE-19 细胞分为3 个组：（1）对照组（control group，CG），正常培养48 h；（2）模型组（model group，MG），先正常培养24 h 后，给予含1 mg/mL 碘酸钠的完全培养基刺激24 h；（3）黄芩苷组（baicalin group，BG），黄芩苷浓度设定为，0.1、1.0、10.0、25.0、50.0、100.0、200.0 µmol/L，含有以上不同浓度黄芩苷的培养基孵育24 h 后，给予含1 mg/mL碘酸钠的完全培养基刺激24 h。按照上述分组处理方式处理后，再继续培养24、48、72 h。

1.4 CCK-8法检测ARPE-19细胞活力

在96 孔板中接种ARPE-19 细胞悬液，在培养箱中预培养，分组处理细胞后，每孔加10 µL 的CCK-8 溶液，在培养箱内避光孵育2 h，以酶标仪测定450 nm处的光密度（optical density，OD）值。

1.5 免疫荧光法观察细胞形态

吸出各组对数生长期的ARPE-19细胞培养液，进行DAPI 染色，洗涤后封片，在倒置荧光显微镜下观察各组细胞的形态。

1.6 Western Blot 法检测各组细胞RIPK1、RIPK3、HMGB1蛋白的表达水平

从ARPE-19 细胞中分别提取总蛋白20 µg，经凝胶、电泳和转膜后用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，与RIPK1 抗体（稀释比例1∶1,000）、RIPK3 抗体（稀释比例1∶5,000）、HMGB1 抗体（稀释比例1∶1,000）、GAPDH 抗体（稀释比例1∶1,000）一抗（均为鼠抗）在4℃下孵育过夜后，洗涤3 次，与二抗（山羊抗兔，稀释比例1∶5,000）孵育1 h，再次洗涤3 次后进行显影。用酶标仪测定光密度（optical density，OD）值，根据标准曲线计算出蛋白浓度。

1.7 统计学方法

采用Graphpad Prism 5 统计软件对数据进行分析，计量资料数据采用均数±标准差（）表示，符合正态分布且方差齐的计量资料，方差分析（ANOVA）进行多组变量间的相互比较，两两比较采用LSD-t检验。当P＜0.05时，认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黄芩苷安全浓度范围测定

8组间不同浓度黄芪苷处理ARPE-19细胞24 h后的细胞活力比较，差异有统计学意义（F=36.120，P=0.000）。两两比较：与0 µmol/L 组比较，0.1、1.0、10.0、25.0 µmol/L 组的细胞活力差异无统计学意义（均P＞0.05），50.0、100.0、200.0µmol/L 组的细胞活力均降低，差异有统计学意义（t50.0=3.236，P=0.032；t100.0=6.165，P=0.004；t200.0=7.840，P=0.001）。与25.0 µmol/L 组比较，1.0、10.0、50.0 µmol/L 组的细胞活力差异无统计学意义（均P＞0.05），0.1µmol/L组的细 胞活力升高（t=4.848，P=0.008），100.0、200.0 µmol/L 组的细胞活力降低（t100.0=9.714，P=0.001；t200.0=9.485，P=0.001），差异均有统计学意义。因此，黄芩苷的安全浓度范围为0～25.0µmol/L（表1）。

表1 不同浓度黄芩苷对ARPE-19细胞活性的影响（，n=3）

表1 不同浓度黄芩苷对ARPE-19细胞活性的影响（，n=3）

注：* 与0 µmol/L 组比较，P<0.05；# 与25.0 µmol/L 组比较，P<0.05

2.2 黄芩苷对ARPE-19细胞的最佳有效浓度

6 组间细胞活力比较，差异有统计学意义（F=75.789，P=0.000）。两两比较，与CG 组比较，其余各组细胞活力均下降，差异有统计学意义（tMG=12.769，t0.1=12.137，t1.0=10.542，均P=0.000；t10.0=8.188，P=0.001；t25.0=5.237，P=0.006）；与MG 组比较，黄芩苷1.0、10.0、25.0µmol/L 浓度组细胞活力均上升，差异有统计学意义（t1.0=4.869，P=0.008；t10.0=8.824，P=0.001；t25.0=9.854，P=0.001），0.1 µmol/L 浓度组细胞活力差异无统计学意义（P＞0.05）。当黄芩苷浓度为25.0 µmol/L 时，细胞活性最高，与0.1、1.0、10.0µmol/L 浓度组比较，差异均有统计学意义（t0.1=8.987，P=0.001；t1.0=6.809，P=0.002；t10.0=3.320，P=0.029），故本实验选择25.0µmol/L 黄芩苷进行后续试验（表2）。

表2 黄芪苷对ARPE-19细胞的最佳有效浓度（，n=3）

表2 黄芪苷对ARPE-19细胞的最佳有效浓度（，n=3）

注：* 与CG 组比较，P<0.05；# 与MG 组比较，P<0.05；&与25.0µmol/L组比较，P<0.05；CG 对照组；MG 模型组；BG 黄芩苷组

2.3 黄芩苷对ARPE-19细胞的最佳给药时间

3 组间不同给药时间的细胞活力比较，差异有统计学意义（F24h=46.332，F48h=82.269，F72h=210.724，均P=0.000）。两两比较，（1）24 h：与CG 组比较，MG 组细胞活力下降（t=8.118，P=0.001）；与MG 组比较，BG 组细胞 活力升 高（t=8.632，P=0.001），差异均有统计学意义。（2）48 h：与CG 组比较，MG 组细胞活力下降（t=12.330，P=0.000）；与MG组比较，BG组细胞活力升高（t=12.148，P=0.000），差异均有统计学意义。（3）72 h：与CG组比较，MG组细胞活力下降（t=26.873，P=0.000）；与MG 组比较，BG组细胞活力升高（t=10.539，P=0.000），差异均有统计学意义（表3）。上述数据表明，与MG 组比较，在不同的给药时间BG 组的细胞活力均有提高，故最短的24 h为最佳给药时间。

表3 黄芩苷对ARPE-19细胞的最佳给药时间（，n=3）

表3 黄芩苷对ARPE-19细胞的最佳给药时间（，n=3）

注：*与CG 相比，P<0.05；#与MG 相比，P<0.05；CG 对照组；MG模型组；BG 黄芩苷组

2.4 黄芩苷对ARPE-19细胞形态的影响

在24 h、48 h 或72 h 时，CG 组ARPE-19 细胞核均呈强荧光，细胞质无荧光；MG组ARPE-19细胞核均呈现核浓缩，染色加深，部分细胞表现为核碎裂；BG 组ARPE-19 细胞核均呈现强荧光，核碎裂现象减少（图1）。

图1 黄芩苷对ARPE-19细胞形态的影响（免疫荧光染色，×400）

2.5 黄芩苷对ARPE-19 细胞RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路的影响

检测黄芩苷给药24 h 后的ARPE-19 细胞RIPK1、RIPK3 和HMGB1 蛋白的表达水平，结果显示，3 组间RIPK1、RIPK3、HMGB1 表达水平比较，差异有统计学意义（FRIPK1=34.303，FRIPK3=31.690，FHMGB1=11.148，均P=0.000）。两两比较，（1）RIPK1：与CG组比较，MG 组RIPK1 表达水平升高（t=7.352，P=0.002）；与MG组比较，BG组RIPK1表达水平下降（t=7.012，P=0.002），差异均有统计学意义。（2）RIPK3：与CG 组比较，MG 组RIPK3 表达水平升高（t=6.926，P=0.002）；与MG 组比较，BG 组RIPK3 表达水平下降（t=6.085，P=0.004），差异均有统计学意义。（3）HMGB1：与CG 组比较，MG 组HMGB1 表达水平升 高（t=3.785，P=0.019）；与MG 组比较，BG 组HMGB1表达水平下降（t=3.386，P=0.028），差异均有统计学意义（图2、表4）。

表4 黄芩苷对ARPE-19细胞RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路的影响（，n=3）

表4 黄芩苷对ARPE-19细胞RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路的影响（，n=3）

注：*与CG组比较，P<0.05；#MG组比较，P<0.05；RIPK1受体相互作用蛋白激酶1；RIPK3 受体相互作用蛋白激酶3；HMGB1 高迁移率族蛋白B1；CG 对照组；MG 模型组；BG 黄芩苷组

图2 黄芩苷对ARPE-19细胞RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路的影响

3 讨论

目前，AMD 的发病机制尚不十分明确，可能与氧化应激、光损伤、炎症、遗传基因等因素相关[11]。AMD 可分为干性和湿性2 种类型，湿性AMD(wet age-related macular degeneration,wAMD)临床表现严重，但dAMD 发病率更高[12]。dAMD 早期在视网膜下出现一种称为玻璃膜疣的沉积，晚期则出现RPE细胞广泛变性的地图样萎缩，导致严重的视野丧失[13]。现阶段，对于dAMD 则无有效的预防或治疗手段[14]。虽然目前dAMD 的发病机制尚未完全阐明，但有研究[15]发现RPE 细胞的凋亡致使其他正常细胞生理功能缺失，可能导致dAMD 视网膜形成玻璃膜疣沉积，从而增加形成dAMD 的风险。RPE 细胞位于视网膜和脉络膜之间，由表面极化的色素上皮细胞组成，具有多种重要的生理功能[16]。现已有研究[17-20]证实，RPE 细胞的凋亡与dAMD 的发生发展密切相关。

黄芩是一种常见的药用植物，是治疗肺部疾病、黄疸、高血压等最常用的中药[21-22]。近期，越来越多的研究[23-24]发现，黄芩苷对急、慢性炎症有抑制作用和抗过敏作用[25]，能通过抗血管生成、抗凋亡、等途径对视网膜病变、AMD 等眼部疾病发挥积极的治疗作用。本研究首先应用不同浓度黄芩苷处理ARPE-19 细胞，通过CCK-8 检测细胞增殖活力，确定了黄芩苷的安全浓度范围为0～25.0µmol/L；然后通过CCK-8 进一步检测各组细胞增殖活力，选择了25.0 µmol/L 的黄芩苷浓度为ARPE-19 细胞干预的最佳有效浓度；最后通过评价各组24 h、48 h、72 h不同时间点的细胞增殖活力，确定选择24 h 作为最佳给药时间。

有研究[5]在AMD患者和模型小鼠中检测到RPE细胞膜通透性降低、RIPK1 和RIPK3 激活、HMGB1释放，且能观察到细胞肿胀、空泡等细胞坏死性凋亡的特征。也有研究[6]证明，在不同AMD 动物模型中，RIPK1 抑制剂能保护RPE 细胞免受坏死性凋亡的影响，维持了视网膜的视觉功能，是临床dAMD治疗候选药物之一。坏死性凋亡是一种由RIPK1 和RIPK3 以及MLKL 介导的促炎细胞死亡形式，可介导HMGB1 的释放，HMGB1 释放的减少提示MLKL通路受到了抑制[26]。本课题组通过前期预实验发现在碘酸钠诱导的人ARPE-19 细胞凋亡模型中，RIPK1、RIPK3、pRIPK3、MLKL、pMLKL、HMGB1 的蛋白表达水平较CG 组升高。由此可见，RIPK1/RIPK3/MLKL 信号通路的激活可能导致了RPE 细胞的坏死性凋亡，并且与RPE 细胞的坏死性凋亡一起参与并促进了dAMD的发生发展。本实验通过免疫荧光法观察细胞形态，结果显示BG 组ARPE-19 细胞核均呈现强荧光，核碎裂现象减少，提示黄芩苷能有效维持ARPE-19 细胞核稳定，抑制细胞增殖，从而保护RPE 细胞。本实验通过Western Blot 实验，经黄芩苷给药24 h 后，发现RIPK1、RIPK3 和HMGB1蛋白表达水平均下调，提示黄芩苷可抑制细胞增殖和相关蛋白表达，从而抑制细胞坏死性凋亡。这些结果表明，在细胞实验中，黄芩苷可抑制ARPE-19 细胞的增殖、维持细胞核的稳定性，下调RIPK1、RIPK3 和HMGB1 蛋白表达，提示黄芩苷可能是新的RIPK1/RIPK3/MLKL 信号通路抑制剂，可以为dAMD的干预以及治疗提供新的策略。

综上所述，本研究结果显示，RIPK1/RIPK3/MLKL 信号通路介导参与了RPE 细胞的坏死性凋亡。黄芩苷通过调控RIPK1/RIPK3/MLKL 信号通路抑制碘酸钠诱导的细胞坏死性凋亡，对RPE 细胞起到保护作用，从而对dAMD 起到积极的干预作用。本研究可为dAMD 的治疗提供新的思路和理论依据，但本实验样本量有限，还需后期扩大样本量进一步验证、研究。