7 种生物药剂对百香果茎基腐病菌的抑菌效果试验

2022-12-02邝瑞彬周陈平黄炳雄魏岳荣

广东农业科学 2022年10期

邝瑞彬，杨敏，周陈平，杨护，黄炳雄，魏岳荣

（广东省农业科学院果树研究所/农业农村部南亚热带果树生物学与遗传资源利用重点实验室/广东省热带亚热带果树研究重点实验室，广东广州 510640）

【研究意义】百香果（Passif lora edulisSims）是西番莲科西番莲属多年生藤本植物，果肉果汁口感酸甜，营养丰富，集食用、观赏及药用价值于一身，具有十分广阔的市场前景［1］。在我国，近年来百香果产业发展迅猛，主要集中在广西、广东、福建、云南、贵州等地。2019 年初百香果在各栽培区迅猛发展近3.3 万hm2，产量约达100 万t［2］。但是，我国百香果产业发展遭受着茎基腐病的重大威胁。开展百香果茎基腐病综合防治研究，筛选安全高效低毒杀菌剂，对解决该病害问题，促进百香果产业健康发展有重要的意义。【前人研究进展】该病病原菌为土传真菌腐皮镰刀菌（Fusarium sloani）和尖孢镰刀菌（F.oxyporum），病菌以菌丝体、厚垣孢子和菌核存在于土壤中。病菌经土壤侵入百香果根茎基部，导致主蔓茎基部产生褐腐病症，木质部有褐红色栓状堵塞，轻者使叶片黄化、萎蔫，严重时枝蔓枯萎乃至植株枯死，颗粒无收。百香果茎基腐病已逐步蔓延传播至我国各大主产区，部分病重果园发病率达30%～40%，植株死亡率达40%～60%，经济损失巨大［3-6］。我国百香果茎基腐病防治主要采用健康无毒嫁接苗、抗病育种法、轮作间作法以及化学药剂防治等方法。前两者耗时长，实现难度较大；化学杀菌剂使用简单见效快，但是频繁过量使用容易增加农产品质量和安全风险，生态环境受损，不利于百香果产业可持续发展［6-7］。随着现代果树可持续发展生产要求，应避免过度用化学农药，以免产生生态环境污染、农药抗性及农药残留超标等问题［8-9］。利用高效、低毒、易降解的植物源抑菌剂或微生物及其代谢物的生物杀菌剂进行防治，已成为现代农业发展的重要方向［10］。据前人研究报道，植物源生物杀菌剂如苦参碱、乙蒜素、万寿菊杀菌素、多抗霉素、春雷霉素等在防治樱桃茎腐病、苹果轮纹病、西瓜枯萎病、棉花枯萎病、葡萄炭疽病等具有显著的效果［11-15］。微生物源药剂如寡雄腐霉菌剂、枯草芽孢杆菌、木霉菌、AM 菌等对辣椒疫病、苹果轮纹病、人参灰霉病、橡胶炭疽病、水稻纹枯病等防治效果良好［12,16-18］。【本研究切入点】广东省百香果茎基腐病害严重发生，利用高效安全生物杀菌剂进行病害防治，符合人们对绿色健康食品的需求，但目前生物药剂对百香果茎基腐病的抑菌效果尚未见报道。【拟解决的关键问题】本试验利用室内毒力测定和离体测试明确几种生物药剂对百香果茎基腐病病原菌的抑制效果，以期筛选出安全、高效的生物药剂，作为化学杀菌剂的替代或有效补充，为安全高效综合防治百香果茎基腐病提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌种：百香果茎基腐病菌腐皮镰刀菌（F.sloani）菌株FSP1 和FSP6、尖孢镰刀菌（F.oxyporum）菌株FOP1 和FOP2，由广东省农业科学院果树研究提供。

供试植物源药剂为井冈霉素、苦参碱春雷霉素、乙蒜素、多抗霉素，微生物药剂为枯草芽孢杆菌、哈茨木霉。其中8%井冈霉素水剂购自武汉科诺生物科技股份有限公司，1%苦参碱水剂购自广东园田生物工程有限公司，2%春雷霉素可溶液剂购自山东澳得利化工有限公司，20%乙蒜素可湿性粉剂购自天津市汉邦植物保护剂有限责任公司，10%多抗霉素可湿性粉剂购自百事德生物化学科技有限公司，1×109CFU 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）粉剂和5×108CFU 哈茨木霉粉剂购自武汉科诺生物科技股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 室内毒力测定病原菌培养：病原菌菌株在PDA 培养基中活化，用灭菌打孔器（直径为6 mm）取菌块继代培养1 次。在超净工作台中用打孔器在已纯化培养的菌落边缘打孔，用灭菌挑种针挑取菌饼，放在PDA 培养基中央，用封口膜将其封好，倒置放入28℃的培养箱中培养6 d，待用。

毒力测定：采用菌丝生长速率进行室内毒力测定。7 种生物药剂用无菌水配制好母液，按照试验设计稀释成设定目标浓度10 倍的药剂浓度备用，按比例添加到预热到45℃的PDA 培养基中充分混匀，配置成不同浓度的含药培养基。参考药剂推荐剂量和前人研究结果，设置井冈霉素、春雷霉素、乙蒜素的浓度为0.5、5、50、500 mg/L，苦参碱浓度为5、50、500、1 000 mg/L，多抗霉素浓度为5、50、500、2 000 mg/L，枯草芽孢杆菌、哈茨木霉浓度为104、105、106、107CFU/g，以不添加任何杀菌剂的PDA 培养基作为空白对照。每个培养皿（直径 9 mm）倒入20 mL 培养基，每个处理4 次重复。

用打孔器在菌株FSP6 菌落依次打取菌饼（直径6 mm），将菌饼接种于上述含药PDA 培养基中心位置，用封口膜密封培养皿防止污染，将平板倒置放于28℃恒温条件下培养。6 d 后，采用十字交叉法测量菌落直径并记录数据，计算抑制率：抑制率(%)=(对照菌落直径－处理菌落直径)/（对照菌落直径-菌饼直径）×100［19］。利用药剂的浓度对数值与药剂的抑制率几率值的直线相关关系，使用EXCEL2010 进行回归分析，求出供试药剂的毒力回归方程和相关系数R2、抑菌中浓度EC50值。试验中,EC50值最低的药剂为标准药剂，相对毒力系数＝标准药剂EC50/供试药剂EC50×100［20］。

1.2.2 菌落形态观察培养后6 d，记录菌落颜色、形态及生长情况，用光学显微镜观察、记录病原菌的菌丝、隔膜、分生孢子等形态特征。

1.2.3 不同菌株对生物药剂的反应另取菌株FSP1、FSP6、FOP1 和FOP2 在PDA 培养基中活化，根据毒力测试结果，选取适当浓度的药剂井冈霉素（10 mg/L）、春雷霉素（50 mg/L）、乙蒜素（50 mg/L）、枯草芽孢杆菌（1×106CFU/g）配置PDA培养基药处理。按1.2.1的方法进行培养，6 d 后计算相对抑制率［21］。

1.2.4 生物剂对百香果茎基腐病的防治试验离体试验参考邝瑞彬等［6］的方法，选取成熟匀称的百香果枝条，选取适当浓度的药剂井冈霉素（10 mg/L）、春雷霉素（50 mg/L）、乙蒜素（50 mg/L）、枯草杆菌（106CFU/g）设置处理，以无菌水为对照，共5 个处理，每个处理3 次重复，每个重复8 个茎段。药剂处理枝条后风干5 min，用灭菌刀片在枝条中部划约5 mm×5 mm 伤口，再均匀放置FSP6 菌块在伤口处进行接种。将接种好的枝条放置在垫有湿润吸水纸的培养皿中，置于植物恒温培养箱（28 ℃，湿度80%），6 d 后观察记录处理茎段的病菌侵染情况。

田间试验设在怀集县桥头镇百香果试验基地，该基地已连续种植百香果4 年，果园茎基腐病发生严重，试验时间为2021 年4－6 月（雨季），供试品种为台农1 号百香果，扦插苗源，越冬成熟植株，设置井冈霉素10 mg/L、春雷霉素50 mg/L、乙蒜素50 mg/L、枯草芽孢杆菌106CFU/g 和清水对照5 个处理，每个处理3 次重复，每个重复20株，采用淋施和涂抹茎基部方法，每2 周施药处理1 次，结果季调查植株发病情况。根据茎秆感染程度划分病情等级为5 级，计算病情指数和防治效果：

1.3 数据分析

使用EXCEL2010 进行回归分析，采用SPSS 19.0 软件对试验数据进行显著性分析，采用Duncan新复极差法进行差异显著性测验。

2 结果与分析

2.1 生物药剂室内毒力测试

将菌株FSP6 接种在不同浓度药剂处理的培养基中，采用菌丝生长速率法进行室内毒力测定。回归分析结果见表1，本测试的植物性药剂和微生物药剂处理均能抑制菌株菌落生长，药剂浓度越大，抑制作用越强，且不同杀菌剂间的毒力差别较大。植物性药剂中以井冈霉素的毒力最强，抑菌效果最好、EC50值为7.79 mg/L，其次为春雷霉素和乙蒜素、EC50值分别为26.35 和28.65 mg/L，苦参碱次之，多抗霉素毒力最弱、EC50值达1 150.29 mg/L。微生物药剂中，枯草芽孢杆菌毒力比哈茨木霉更强，其EC50值为3.2×106CFU/g。

表1 不同药剂室内毒力测试结果比较Table 1 Indoor toxicity test results of different fungicides

2.2 生物药剂对菌株生长与形态的影响

百香果茎基腐病菌株FSP6 分别接种到7 种含药PDA 平板中，培养6 d 后，挑取孢子菌丝利用光学显微镜观察其形态特征。如图1 和表2 结果显示，不同药剂处理对菌株孢子生长及形态均有一定的抑制作用。空白对照中，FSP6 的分生孢子为两端微尖镰刀型，一般为2～4 个隔，长度约为75.1～156.4 μm，小孢子为长卵形，35.3～63.3 μm；药剂处理后，除了多抗霉素外，其余6 种药剂处理的孢子显著短于对照，尤其是苦参碱、春雷霉素、乙蒜素处理的孢子多为2 隔，两端较钝，孢子长度极显著小于对照。枯草芽孢杆菌处理分生孢子多为2～3 隔，孢子两端较钝，部分孢子肿胀畸形，孢壁破碎，细胞质质体泄漏。

表2 不同药剂对百香果茎基腐病菌株菌落及孢子形态的影响Table 2 Effects of different fungicides on the colony and spore morphology of pathogen strains from stem rot diseased passion fruits

图1 不同药剂对百香果茎基腐病菌株孢子生长形态的影响Fig.1 Effects of different fungicides on the growth morphology of pathogen strain from stem rot diseased passion fruit

2.3 药剂处理对茎基腐病原菌不同菌株生长的影响

根据室内毒力测试结果，4 种抑菌效果较好的药剂井冈霉素（10 mg/L）、春雷霉素（50 mg/L）、乙蒜素（50 mg/L）和枯草芽孢杆菌（106CFU/g）被选取用于测试不同菌株反应，测试菌株为前研究中百香果茎基腐病株分离并显示致病力较强的菌株FSP1、FSP6、FOP1 和FOP2，测试结果见图2，4 种药剂处理均能达到较好的抑菌效果，药剂处理菌落直径显著小于无药剂对照。在井冈霉素（10 mg/L）、春雷霉素（50 mg/L）和乙蒜素（50 mg/L）药剂处理中，同一药剂处理对不同菌株的抑制效果略有差异，对FOP1 和FOP2 的抑制作用显著大于FSP1 和FSP6；而在枯草芽孢杆菌处理中，药剂对4 个菌株的抑制效果最好，菌株间差异不显著。测试结果表明，这4 种生物药剂均可抑制百香果茎基腐病菌株生长，可用于该病害防治。

图2 生物药剂对百香果茎基腐病不同菌株生长的影响Fig.2 Effects of biological fungicides on the growth of pathogen strains from stem rot diseased passion fruits

2.4 生物源药剂对离体百香果茎基腐病的防治效果

根据室内毒力测试结果，4 种抑菌效果较好的药剂井冈霉素（10 mg/L）、春雷霉素（50 mg/L）、乙蒜素（50 mg/L）和枯草芽孢杆菌（106CFU/g）被选取用于测试百香果茎枝的茎基腐病防治效果。如表3 所示，4 个药剂处理的离体枝条病情指数均显著低于对照，结合防效结果看，枯草芽孢杆菌的效果最佳，防治效果达70.6%，显著高于其他药剂处理；井冈霉素次之；春雷霉素和乙蒜素处理略低，分别为32.4%和29.4%，两者差异不显著。田间试验结果显示，试验园区茎基腐病害发生严重，病情指数达52.0%，与不喷药对照相比，4 个药剂处理的病情指数显著降低，其中井冈霉素和枯草芽孢杆菌的防治效果较佳、分别为53.7%和61.3%，春雷霉素和乙蒜素处理防治效果则较低、分别为38.5%和34.2%。田间试验的防治效果结果与室内检测结果较为一致，但是枯草芽孢杆菌处理的防效略低于室内检测结果，可能与其为微生物来源有关，其田间试验条件受环境如水分、土壤等影响较大，但田间观察该处理百香果植株长势明显优于对照，果实的品质有所提高，应用前景较好。

表3 生物药剂对百香果茎基腐病的防治效果Table 3 Control effects of biological fungicides on pathogen strains from stem rot diseased passion fruits

3 讨论

百香果茎基腐病危害甚广，在南美巴西、非洲、澳大利亚及韩国等东南亚国家与我国主产区如广东、广西、福建及海南等地均有报道，发病时间集中多在春夏多雨季节，经济效益严重受损［3-5］。其防控方法以化学防治较为迅速、有效，笔者在前期研究发现杀菌剂30%苯甲嘧菌酯和60%霜脲嘧菌酯、咪鲜胺、春雷王铜等混用或轮用，可较好防治百香果茎基腐病害［6］。百香果现代生产要保证有效控制病害，且需兼顾果实品质安全和生态环保，研究使用安全、低毒、不易诱发抗药性的生物药剂，应用前景非常广阔。本研究开展了7 种植物源及微生物药剂对百香果茎基腐病致病菌株的孢子生长及形态的影响试验，经室内毒力测试和防治效果试验，筛选了两种抑菌效果较好的生物药剂。结果表明所测药剂中抑菌效果最佳为井冈霉素（EC50为7.79 mg/L），其次为春雷霉素和乙蒜素，苦参碱毒力较弱，多抗霉素的毒力最弱；微生物药剂以枯草芽孢杆菌效果较好。前人研究发现井冈霉素对镰刀菌引起的樱桃茎腐病、小麦茎基腐病、党参根腐病菌等亦具有较好防治效果［11,22-23］，本试验中井冈霉素对百香果茎基腐病原菌具有抑制作用，防治效果良好，与前人研究结果一致。林霞等［11］测定9种生物杀菌剂对樱桃茎腐病菌的毒力，发现丁子香酚抑制效果最好，其次为乙蒜素和蛇床子素，多抗霉素则没有抑制效果。柳自清等［14］通过毒力测定和田间防病试验测试3 种生物药剂对棉花枯萎病的防效，其中乙蒜素乳油效果最佳，田间防效为67.27%。吴晓云等［24］研究发现生物杀菌剂枯草芽孢杆菌对草莓根腐病具有较好的防治效果，防效在70%以上，与化学药剂甲基硫菌灵效果相当。本研究结果与上述研究镰刀菌防治试验结果近似，对百香果茎基腐病害防治具有一定的应用指导作用。

试验筛选的供试生物药剂与常规化学杀菌剂作用机理不同。井冈霉素是微生物发酵过程中产生的次生代谢物，能抑制真菌的海藻糖酶活性及纤维素降解酶、多聚半乳糖醛酸酶和肌醇生物合成的活性，对真菌的生长、毒素合成和致病力产生影响，对水稻纹枯病等真菌病害的防治作用已广泛报道［25］，本试验中井冈霉素对百香果茎基腐病及前人报道的镰刀菌引起的真菌病害同样具有良好的抑制作用。苦参碱是由苦参根茎等部位有机提取制成，主要成分为生物碱和黄酮类，对黄瓜灰霉病菌、樱桃茎腐瘸菌和苹果树腐烂病菌等具有抑制效果［11,26-27］，本试验中，百香果茎基腐病菌亦受到苦参碱药剂的抑制，但效果不如井冈霉素显著。乙蒜素和春雷霉素属于植物仿生农药，来源于安全的天然物，具有低毒、低残留的优点，对葡萄炭疽病、苹果腐烂病等抑菌效果良好［15,28］。本试验结果亦表明乙蒜素和春雷霉素药剂处理使病菌孢子生长和形态产生抑制作用，其毒力仅次于井冈霉素，具有良好的防效。枯草芽孢杆菌（B.subtilis），是一种嗜温、好氧、产芽孢的杆状细菌，容易分离培养，对人畜安全,环保，研究表明对防治油菜根肿病、棉花黄萎病等病害都有良好的防治效果［28-29］。前人研究认为枯草芽孢杆菌抑菌的机理主要是与病原菌竞争空间和营养物质，且通过自身代谢活动产生多种抗菌素和酶，诱导植物抗病性；且分泌的脂肽类化合物和抗菌蛋白使细胞膜表面张力受到影响，导致离子的渗漏，菌丝畸形且细胞壁溶解［30-31］。本研究中发现经枯草芽孢杆菌药剂处理的百香果茎基腐病菌群生长受到抑制、产生畸形分生孢子，孢壁溶解，原生质体外溢的现象，与前人研究结果一致。哈茨木霉对病原菌菌丝有强大的竞争能力和强烈的寄生作用，且分泌胞外溶菌酶抑制菌的生长，达到减轻病害的效果，在本试验中，哈茨木霉对茎基腐病原菌有较好的抑制作用，但效果不如枯草芽孢杆菌。本试验筛选的生物源药剂毒力较强，安全无毒，具有良好的应用前景。