HPLC法同时测定贞术调脂浓缩丸中5种成分

2022-12-02陈吉生

中成药 2022年7期

潘力，李勇，陈吉生

(1.广东药科大学附属第一医院药学部，广东广州 510030；2.广东药科大学新药研发中心，广东广州 510006)

贞术调脂方由女贞子、白术、黄连、丹参、三七等药材组成，具有补益脾肾、疏肝化痰、祛脂降淤之功效，用于治疗肝肾不足、浊淤内滞所致的高血脂症，具有确切的降血脂、降血糖作用[1-4]，还可抗骨质疏松[5-6]。方中君药女贞子所含齐墩果酸、特女贞苷有降血脂、降血糖、抑菌抗病毒等作用[7-8]；黄连所含生物碱可保护心血管，有效控制血糖水平[9-10]；丹参水提物所含酚酸能改善脂质代谢过程，具有保肝抗炎、降血脂、防治动脉粥样硬化作用[11-12]。该方在广东药科大学附属第一医院以胶囊剂的形式使用多年，现将其进一步开发成药效好、体积小、便于服用的浓缩丸[13-14]，可增加患者依从性，提高疗效，节约成本，但改变剂型后有效成分种类与含量也会随之变化，前期胶囊剂中相关测定方法[15-16]已不适用。

因此，本实验采用HPLC法同时测定贞术调脂浓缩丸中特女贞苷、丹酚酸A、丹酚酸B、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱的含量，以期保证该制剂的安全性与有效性，并为其质量标准制定提供参考。

1 材料

1.1 仪器 Dionex Ultimate 3000高效液相色谱仪(配置Sampler WPS-3000SL自动进样器、Chromeleon色谱工作站，美国戴安公司)；RCCHIRAL Gensial C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，4 μm，广州研创生物技术发展有限公司)；SK7200LHC型超声波清洗器(功率350 W，频率53 kHz，上海科导超声仪器有限公司)；BS224S型电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]。

1.2 试剂与药物贞术调脂浓缩丸(中试加工产品，批号200901、200902、200903)。特女贞苷(批号P25J9L64240，纯度98%)、丹酚酸A(批号P28F10F81663，纯度98%)、丹酚酸B(批号P18J9F65871，纯度98%)对照品均购自上海源叶生物科技有限公司；盐酸小檗碱(批号110713-201212，纯度86.7%)对照品购自中国食品药品检定研究院；盐酸巴马汀(批号20022610，纯度98%)对照品购自成都曼斯特生物科技有限公司。乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 RCCHIRAL Gensial C18色谱柱(250 mm × 4.6 mm，4 μm)；流动相乙腈(A)-水(B)(含0.1%磷酸、0.2%三乙胺，pH=4.65)，梯度洗脱(0～15 min, 10%A; 15～40 min, 10%～16.5%A; 40～90 min, 16.5%～26.8%A)；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长224 nm。

2.2 对照品溶液制备精密称取丹酚酸B、特女贞苷、丹酚酸A、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱对照品适量，甲醇溶解，制成分别含丹酚酸B 0.505 0 mg/mL、特女贞苷0.779 6 mg/mL、丹酚酸A 0.685 9 mg/mL、盐酸巴马汀0.484 0 mg/mL、盐酸小檗碱0.533 0 mg/mL的贮备液，分别精密吸取1.58、1.28、0.58、0.41、1.31 mL，置于同一10 mL量瓶中，甲醇定容，摇匀，即得(含丹酚酸B 0.079 79 mg/mL、特女贞苷0.099 79 mg/mL、丹酚酸A 0.039 78 mg/mL、盐酸巴马汀0.019 84 mg/mL、盐酸小檗碱0.069 82 mg/mL)。

2.3 供试品溶液制备取本品适量，粉碎，取约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声(功率350 W、频率53 kHz)处理20 min，放冷，70%甲醇补足减失的质量，摇匀，静置，取上层清液，0.45 μm滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.4 阴性样品溶液制备按照处方中各药材比例与制备工艺，制得缺丹参、女贞子、黄连的阴性样品，按“2.3”项下方法制备，即得。

2.5 系统适用性考察与专属性试验取对照品、供试品、阴性样品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，对照品、供试品溶液色谱图中均有保留时间相同的色谱峰，而且分离度理想，阴性无干扰，并在阴性样品溶液未发现，表明该方法专属性良好。

2.6 线性关系考察精密量取“2.2”项下对照品溶液，置于同一量瓶中，甲醇稀释成5种质量浓度，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以各成分质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系

2.7 精密度试验按“2.3”项下方法制备供试品溶液1份，在“2.1”项色谱条件下进样测定6次，测得丹酚酸B、特女贞苷、丹酚酸A、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱峰面积RSD分别为1.91%、0.48%、2.28%、1.16%、0.94%，表明仪器精密度良好。

2.8 稳定性试验按“2.3”项下方法制备供试品溶液1份，室温下于0、3、6、9、12、24 h在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得丹酚酸B、特女贞苷、丹酚酸A、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱峰面积RSD分别为0.92%、0.41%、0.46%、1.88%、0.59%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.9 重复性试验取同一批本品(批号200901)，按“2.3”项下方法制备供试品溶液6份，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得丹酚酸B、特女贞苷、丹酚酸A、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱含量RSD分别为2.04%、0.17%、1.86%、1.40%、1.08%，表明该方法重复性良好。

2.10 加样回收率试验取各成分含量已知的同一批本品(批号200901)适量，粉碎，精密称取0.25 g，置于具塞锥形瓶中，分别加入“2.2”项下对照品溶液1.10、0.70、0.33、0.29、0.85 mL，按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表2。

2.11 样品含量测定取3批本品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，外标一点法计算含量，结果见表3。

3 讨论

本实验考察了不同提取溶剂(甲醇、70%甲醇、50%甲醇)、提取时间(10、20、30 min)，发现70%甲醇超声提取20 min时各成分能被同时提取，提取率较理想，而且提取液中杂质含量较低。

表2 各成分加样回收率试验结果(n=6)

表3 各成分含量测定结果(mg/g，n=3)

课题组前期以乙腈-水(含0.1%磷酸)为流动相洗脱时，盐酸巴马汀、盐酸小檗碱峰形较差，峰展开较宽，出现拖尾现象，而加入三乙胺可以改善其峰型[17]，当其质量分数为0.05%、0.1%时，对色谱基线影响不大，但对上述2种生物碱峰形的改善作用较小；为0.3%时，色谱基线漂移严重，噪音较大，不利于色谱峰的分辨与积分，最终确定为0.2%，此时两者峰形较好，基线基本平稳。另外，由于三乙胺呈碱性，加到流动相中时会对pH产生影响，从而使保留时间不一致，故需再加入微量磷酸或三乙胺调节pH至4.65。