刘鑫行, 王思贤, 孙 斌, 张竟月, 王金涛

(1.中国计量大学, 浙江 杭州 310018; 2.中国计量科学研究院, 北京 100029)

1 引 言

超微容量在生物、医药、化工等领域应用十分广泛,如基因工程测序实验常用1 μL的超微容量[1]、生化分析仪单次加液量精度也达到1 μL[2]。随着这些领域的快速发展,市场对移液器等微小容量计量器具的需求越来越高[3]。基于胡克定律设计的移液器在长期使用过程中,内部弹簧由于磨损等原因,移液器准确率会明显下降。计量器具的失准会影响实验的准确性,尤其是在医疗领域,移液器的准确性会直接导致临床误诊[4],因此移液器必须定期校准[5]。目前,超微容量测量主要有重力法和非重力法。重力法即在实验室内采用高精度电子天平称量移液器转移的液体,通过介质的质量和密度的关系计算出液体的体积。非重力法主要有光学法、滴定法等。滴定法可通过物质间的化学反应来计算转移的容量;光学法则基于溶液吸收光强的能力与溶液浓度的关系来定量分析液体。其中,滴定法更适用于500 μL以上的容量检测;在10 μL以下的超微容量测量中,静力衡量法易受到溶液蒸发的影响[1],必须对称量系统进行防蒸发处理,但称量系统减少蒸发带来误差的方式较为复杂;光学法对实验的环境要求不高且系统针对蒸发处理的方式更为简单,可作为超微容量测量的方式之一。

本文基于光学法设计了超微容量测量实验,按照分光原理分别搭建了以时域分光和空域分光为基础的2套光学测量系统,同时将2套光学测量系统在同一环境中对同一样品进行光度吸收测试,并将计算所得的液体容量与静力衡量法进行比较获得了一致的结论,证明了光学法在超微容量测量领域的有效性。与静力衡量法相比,光学法对于溶液蒸发的处理方法更为简单;而在2套光学系统中,时域分光测量系统的探测器比空域分光测量系统更优,更易于检测低浓度下的超微容量。

2 静力衡量法

JJG 646-2006《移液器检定规程》采用的容量检测方法是基于静力衡量法,通过测量液体质量与密度计算移液器转移液体的体积。按照测量介质不同,静力衡量法可分为水银称重法、水称重法和高氰化钾称重法。水银有毒易挥发,高氰化钾需要配制多个浓度来适配多个测量范围,而蒸馏水无毒且操作方便是目前最常用的方法[6]。

由于测量介质的密度会随温度变化,因此实验室在测量容量时对环境要求较高。在检测移液器前,应提前24 h将移液器放入实验室内,检测时要求室温(20±5) ℃,且室温变化每小时不大于1 ℃，测量溶液的温度与室温温差不大于2 ℃[7]。

水称重法的实验步骤为:首先将电子天平的显示清零,操作移液器并将转移的液体加入天平的称量杯中,待天平稳定后记录液体质量m,同时记录蒸馏水的温度t,连续操作6次或要求的次数。将记录的数据用式(1)进行计算可得20 ℃下移液器转移的体积V20,其中β为体膨胀系数,ρb为砝码密度,ρa为空气密度,ρw为蒸馏水密度[8]。

(1)

式(1)也可表示为式(2),根据蒸馏水温度所对应的K(t)值和电子天平显示的质量m,可计算出20 ℃下转移的体积,其中K(t)如式(3)所示。

V20=m×K(t)

(2)

(3)

以蒸馏水为检定介质的静力衡量法精度高、实验重复性好、操作简单,但对实验环境的要求较高，无法实现在线测量,难以满足目前微小容量检测的市场,且小容量测量时容易受到介质蒸发带来的影响。通常在测量过程中,介质会与周围环境接触发生蒸发现象,尤其是使用高分辨率的电子天平测量液体时,溶液的蒸发现象导致天平的示值不稳定。当天平加载液体至液体完全静止时,电子天平有一个稳定过程无法快速读数,此时介质已经发生了蒸发,影响了实验数据的准确性[9]。

本文采用10 mm光程的比色皿和XP205型号的电子天平在21 ℃实验环境下进行蒸发实验,天平的分辨力为0.000 1 g、检测上限为220 g,对加盖的比色皿和敞开的比色皿进行容量称量,称量数据显示加盖的比色皿在10 min内容量并没有发生变化,而将盖子去除后,天平每隔1 min左右便有0.000 1 g的数据变化,同样在相同时间间隔下电子天平第1次平衡时,数据显示为1.465 9 g,10 min后再次平衡时数据已减小到1.464 9 g,说明当溶液暴露在空气中时,容量测量会明显受到蒸发的影响,若采用更高分辨率的电子天平,则蒸发的现象会更易观测。因此,基于静力衡量法的超微容积检测必须做防蒸发处理。例如微量天平XP26PC，天平内部装有1个防蒸发阱,阱内一般有少量蒸馏水以保持腔内一定的温度和湿度,测量要求严格时需要实时监测防蒸发阱内的温湿度。同时需要定期对防蒸发阱进行维护,比如更换腔内的蒸馏水、用酒精清洗蒸发阱等。

当使用静力衡量法对微小容量进行测量时,测量的准确性和重复性好,但容易受到液体蒸发的影响,且称量系统防蒸发处理的方法与温湿度有关，较为复杂。

3 光学法

为克服重力法实验环境要求高和溶液蒸发的问题,非重力法成为目前研究的趋势。光学法是基于溶液吸光度与浓度的关系,通过稀释溶液吸光度的变化反映加入溶液的体积,且光学法中采用比色皿来盛放溶液,加盖的比色皿可以有效减小蒸发带来的影响。基于光学法的光谱分析实验可分为单波长测量和双波长测量,双波长测量即采用2个波长定性或定量分析溶液。与单波长测量相比,双波长测量通过对溶液吸光度的比值计算,可有效减小比色皿加工误差带来的影响,成为了最常用的光谱分析方法。双波长在测量溶液时需要2个溶液,依次对该溶液进行2个波长的吸光度测试,由于每套系统测量的吸光度各有不同,故将2个溶液按稀释比R配制标准溶液。如式(4)所示,首先测量标准液在2个波长下的吸光度AS1、AS2;然后测量已知体积VD的稀释液的吸光度AD1、AD2;最后通过移液器将体积VU的原液转移至稀释液中,混合后测量混合液在波长1下吸光度AU,移液器加入的溶液体积VU可由式(5)得出。光学法对实验环境要求不高,受溶液蒸发影响小、对溶液蒸发处理方式更简便,故实验选用以双波长测量为基础设计超微容量测量系统。

(4)

(5)

式中:b1和b2为光透过溶液的光程;c1和c2分别为原液和稀释液的浓度;K1和K2分别为标准液原液和稀释液的摩尔吸光系数。

3.1 时域分光和空域分光

双波长测量的微小容量测量实验系统,根据分光方式不同可分为时域分光和空域分光,光束在进入样品室前先对复色光源进行分光处理的方式被称为时域分光或前分光。复色光源在分光系统中由色散元件分光,分光后通过机械装置控制分光元件的转动角度将所需波长的光束入射至样品溶液并由探测器进行测量。时域分光方式实现了复色光源在时间域上的波长分离,波长可根据溶液的特性进行调整。空域分光法又称为后分光,即复色光源先通过样品室,将携带光强信号的光束经分光系统处理后反射至探测器上进行光谱分析。空域分光需将探测器与分光系统固定且探测器的安装与色散元件的反射光路的方向保持一致,通过探测器对各个像元的信号采集,实现复色光源在空间域上全光谱分析。2种分光方式均能实现光谱测量,时域分光法对光源的稳定性和波长重复性要求较高,但光电采集电路相对容易,空域分光法对于光学系统的要求较低,但探测器的驱动电路和信号分析电路较复杂。

3.1.1 色散元件

色散元件是光谱分析实验中最核心的元件。当前最常用的色散元件是光栅和棱镜,2种分光元件的分光原理不同。棱镜对不同波长的光具有不同的折射率,当1束光以入射角θ1进入三棱镜后,不同波长的光会以不同的偏转角θ2射出,实现波长分离;而光栅由于不同波长光的衍射角不同,将复色光源分离成多个单色光。光栅和棱镜各有优缺点,综合比较分光元件的性能,反射光栅色散能力和波长分辨率要优于棱镜,且提高色散能力和波长分辨率的方法也更容易因此实验基于光栅的色散原理结合C-T型光栅分光结构来设计光学系统[10～12]。

3.1.2 光源

在光谱分析中常用的复色光源有氘灯、钨灯和氙灯。氘灯多用于紫外光谱检测,其波长范围在190～400 nm。氙灯和钨灯是可见光波段的常用光源[13,14]。由于实验采用的双波长测量所需的2个波长分别是520 nm和730 nm,故光源在钨灯和氙灯之间选择。而基于双波长测量的超微容量测量系统中时域分光法需要来回调整2个波长,因此对于光源的稳定性和波长的重复性要求较高,2种光学测量方法在经过光栅分光处理后的复色光源能量较弱,每个波长携带的光谱信号不易采集,且在实验过程中采用光纤作为连接件,将光源、分光系统、探测器等结构元件串联在一起,光信号在传输过程中容易发生光强损耗,因此需要对2个光源进行性能测试,选择合适的光源作为容量测量系统的实验光源。

3.1.3 探测器

实验需要将光信号转化为电信号处理,常用的光电探测器有光电二极管、光电倍增管、线阵图像传感器等。时域分光模式的光信号是时间域上的波长分离,在光谱分析中普遍采用光电二极管和光电倍增管。空域分光则是将复色光在空间上分离成单色光可选用图像传感器作为探测器进行吸光度实验。

光电二极管是在光照射的情况下,光子携带能量进入二极管的PN结中,把能量传递给共价键上的电子,部分电子得到能量可以挣脱共价键束缚形成光生载流子,光电二极管在光照下产生的光电流会随光强发生变化[15]。通过检测此电信号,可以得到入射光强的变化。光电倍增管主要基于外光电效应[15],光阴极受到光照射时会激发出光电子,光电子经过二次发射信号扩大,当光强发生变化时信号也会相应变化。

空域分光法的探测器主要有线阵、面阵图像传感器,如CCD、CMOS等。CCD传感器的光电转化主要基于光生伏特效应,即CCD受到光照时其MOS电容器内部半导体或半导体和金属结合的不同部位之间产生了电位差,在数据传输时每个像元将信号传输至底部后由放大器依次放大输出[16]。CMOS中每个像元都有1个放大器,放大器对信号放大后进行信号整合,这样就可保证信号长距离传输时不失真。线阵图像传感器和面阵图像传感器的差异就是光敏元件排布的方式。线阵传感器的感光元件呈线性排布;面阵传感器内部像元呈横纵二维分布,横纵像元均可读取信号方便采集更多信息。

在光谱分析中时域分光法采集到的光信号微弱,可以采用光电倍增管进行信号叠加,但同时增大噪声的干扰,且与光电二极管相比,光电二极管的线性更好、寿命更长;空域分光法实现了全波段测量,CCD与CMOS相比,CMOS的每个像元都要搭配1个放大器,像元真正的感光区域要远小于像元本身,因而同像元尺寸的CMOS传感器的灵敏度和分辨率普遍低于CCD传感器,而且CMOS传感器的放大器之间存在差异,会增大噪声、影响图像信号的完整性。实验基于分光方法的特点和探测器的特性,分别选用光电二极管和线阵CCD作为时域和空域分光法光谱分析的传感器。

3.2 光学系统性能分析

时域分光法对光源的稳定性要求较高,需要对2种光源分别通过光纤与整个系统串联进行性能测试,选取20 W钨灯和5 W氙灯接入系统,通过光电传感器检测光强变化,在相同时间间隔内采集光强信号数据。实验数据显示钨灯光源的稳定性要高于氙灯,氙灯虽然在有限时间内稳定性在0.25%,但长时间测量发现氙灯波动范围大。对比两者数据,探测器检测到的氙灯光源数据偏小,增大了数据引入的不确定性;而20 W的钨灯不仅稳定性好、且经过分光系统分光后的数据均在1 V左右,因此选择钨灯光源作为实验光源能够满足实验要求。同时将钨灯光源经过光栅分光后对系统的波长重复性进行实验,通过机械结构旋转光栅角度来控制2个光束的波长,实验数据表明系统的波长重复性较好。

4 实验与数据分析

本文采用蒸馏水为介质的静力衡量法和以时域分光和空域分光为原理的光学法进行实验,静力衡量法使用的天平为XP26PC,在光学法中将光源、分光系统、样品室、探测器分别按照时域分光和空域分光模式搭建系统,系统结构示意图见图1所示。

图1 时域和空域分光测量系统Fig.1 Time domain optical and spatial spectral measurement system

将2套光学系统在同一环境中对标准液进行吸光度测试,测试数据如表1所示,数据显示比色皿取放前后吸光度略有差异导致标准液吸光度的比值也有所不同,空域分光测量系统的标准液比值稳定性要差于时域分光测量系统。吸光度数据发生变化的主要原因和系统的稳定性有关,2套光学系统的稳定性会受到光源本身、光电检测系统噪声以及样品液的影响,已知光源通过时域分光测量系统测量的电压数据在10 min内并不会明显发生波动,样品液本身也没有变质,因此综上分析系统吸光度的变化主要来自于光电探测器的噪声干扰。

表1 取放比色皿前后标准液吸光度比值AS1/AS2Tab.1 Absorbance ratio AS1/AS2 of standard solution before and after taking and placing the cuvette

探测器的噪声可以通过采集多组数据并做均值化处理来减小干扰。因此将同一标准液放置在样品室内连续采集10次数据后做平均值,然后取出比色皿再放回重新记录吸光度数据,往复10次后标准液吸光度的比值如图2所示,空域分光测量系统的标准液比值在均值化前后稳定性有了较大改善。

均值化处理后,对时域分光、空域分光和静力衡量3种测量法进行微小容量测量,其中1 μL和10 μL的实验测量数据如图3和图4所示,通过公式计算容量相对误差和重复性,计算结果如表2所示。数据显示静力衡量法和光学法能获得一致的结论,2套光学系统均能实现微小容量测量。

表2 光学法和静力衡量法的相对误差和重复性Tab.2 Relative error and repeatability of optical method and gravity method (%)

图2 均值化处前后标准液的比值Fig.2 Ratio of standard solution before and after mean treatment

对比图3和图4两种光学法在1 μL和10 μL测量数据,空域分光测量系统的数据小于时域分光测量系统。同样地,测试1支100 μL定点移液器,时域分光法测量的数据为101.39 μL,空域分光测量的数据为100.90 μL,时域分光测量数据依然大于空域分光测量数据,其主要原因可能是空域分光系统的CCD探测器的灵敏度低于时域分光系统的探测器。为了进行验证,配制浓度为1.85 g/L的溶液并做0.5 μL超微容量测量实验,测试1支经过校准的0.5 μL的移液器,实验发现稀释液在520 nm处的吸光度与加入0.5 μL原液后的混合液在520 nm处的吸光度相比,时域分光测量系统的吸光度响应大于空域分光测量系统,从同一溶液的容量数据看,时域分光测量的容量为0.42 μL,而空域分光测量的容量为0.26 μL,两者数据差距较大且空域分光系统测量的数据超出了规程的容量允许误差。因此,当原液浓度较低并且做超微容量测量时,光电二极管和CCD相比,光电二极管的灵敏度更高,能够采集更多的光强变化信息。

图3 1 μL测量点测量数据Fig.3 Experiment data of 1 μL measuring point

图4 10 μL测量点测量数据Fig.4 Experiment data of 10 μL measuring point

从表2的数据分析,2套光学测量系统的重复性差别较小,主要原因是对空域分光系统的测量数据进行均值化处理。

图5为200 μL测量点数据,均值化处理前容量数据为197.819 μL,重复性为0.73%;均值化处理后容量数据为197.546 μL,重复性为0.41%,均值化的处理改善了系统的稳定性,缩小了2套光学系统的重复性差距。

图5 200 μL测量点数据Fig.5 200 μLmeasurement point data

5 总 结

通过实验数据可得出以下结论:1)通过光学法对微小溶液进行测量能够计算出待测溶液的体积,在1 μL和10 μL测量实验中,时域分光法测得数据为0.959 μL和9.976 μL,重复性为3.21%和2.54%;空域分光法测得数据为0.926 μL和9.729 μL,重复性为3.60%和2.02%;静力衡量法测量数据为0.958 μL和10.005 μL,重复性为1.99%和0.98%。3种系统所得的相对误差和重复性均满足规程要求且结论一致,因此光学法和静力衡量法均能测量超微溶液的容量;2)时域分光法测量的容量数据要大于空域分光法,但两者的重复性并没有明显差距。主要是因为探测器的灵敏度更高,在低浓度下的超微容量测量能够检测更多信息;3)基于光学法的容量测量方法对环境的要求不高,在实验操作中可有效减少容量蒸发带来的影响,并与静力衡量法相比,系统对溶液蒸发的处理方式更加简单。