王立超，苏胜荣，陈凤毛*，董晓燕，田成连，王 洋

(1.南京林业大学林学院，南方现代林业协同创新中心，江苏 南京 210037；2.黄山学院生命与环境科学学院，安徽 黄山 245041；3.黄山市林业局，安徽 黄山 245021)

松材线虫是一种毁灭性的外来入侵生物，其起源于北美，后通过贸易活动相继传播到日本和中国[1]。我国于1982年在南京日本黑松(Pinusthunbergii)上首次分离到松材线虫[2]，至今已有近40年历史，为控制松材线虫病的发生发展，多种化学、物理和生物技术运用于松材线虫的治理工作[3-5]。由于松材线虫病防治工作涉及病原、寄主、媒介昆虫、人为活动以及地理环境等多重因素而成效不佳，导致该病在我国的发生面积和致死松树数量仍在不断增加，且呈现出由南向北不断扩散的趋势[6]，2016年，松材线虫突破10 ℃气温界限传播到辽宁省大连市[7]。我国现有至少16种松树可以在自然条件下发生松材线虫病[3]，感病植物也由原来的松属(Pinus)植物扩展到落叶松属(Larix)植物[3,8]。2019年，松材线虫被国家林业和草原局列为一级危害性林业有害生物[9]。根据2021年松材线虫病疫区公告，我国现有19个省(自治区、直辖市)728个县级行政区发生松材线虫病[10]，不仅导致大量的经济损失和严重的生态破坏，还对我国著名生态旅游景区泰山、庐山和黄山等地松树以及生态安全构成严重威胁。黄山市作为我国著名生态旅游城市，其松林面积占整体森林面积的20.7%[11]，松树种类主要包括马尾松(P.massoniana)和黄山松(P.taiwanensis)，两种松树均为感病树种，其中马尾松作为荒山造林先锋树种，在黄山市分布广泛；黄山松则主要分布在黄山风景区，黄山风景区也因造型奇特的黄山松而闻名世界，文化和生态价值不可估量，但是黄山市黄山区于2018年被划定为松材线虫病疫区[12]，2019年黄山市除黄山风景区外，其辖区内的三区四县均被划定为松材线虫病疫区[13]。目前，黄山风景区四周均为松材线虫病疫区，松材线虫已对黄山风景区造成前所未有的生态威胁。

松材线虫寄生在松树体内，在自然界中需要借助媒介昆虫进行传播。现有报道可以携带松材线虫的媒介昆虫涉及天牛科(Cerambycidae)、小蠹科(Scolytidae)、吉丁科(Buprestidae)、叩甲科(Elateridae)、白蚁科(Termitidae)和象甲科(Curculionidae)等[14-18]，其中天牛科是最主要的携带者和传播者。在我国已经报道可以携带线虫的媒介天牛包括松墨天牛(Monochamusalternatus)、云杉花墨天牛(M.saltuarius)、褐梗天牛(Arhopalusrusticus)、西藏墨天牛(M.nigromaculatus)、短角幽天牛(Spondylisbuprestoides)、小灰长角天牛(Acanthocinusgriseus)、台湾长角天牛(Acanthocinustaiwannensis)、粗鞘双条杉天牛(Semanotussinoauster)、樟泥色天牛(Uraechaangusta)以及桃红颈天牛(Aromiabungii)[18-22]。黄山作为松材线虫病防控重点区域之一，除赵锦年等[22]对黄山风景区内媒介昆虫调查外，未见其他研究报道。为此，笔者以黄山市博村林场为实验点，通过室内和室外收集天牛，调查黄山地区松材线虫的媒介天牛以及天牛携带线虫的规律，为黄山市松材线虫病的科学防控提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 样地概况

试验地选择在安徽省黄山市博村林场马尾松林内(118°17′30″E，29°41′51″N)，属皖南山区变层岩系的低山、丘陵地区，海拔200～380 m，年平均气温为15.5～16.3 ℃，极端最高气温可达41 ℃，1月平均气温为3.5 ℃，7月平均气温为27.9 ℃，地表平均气温为17.9～19.3 ℃，平均无霜期达260 d，年降水量为1 350～1 650 mm，平均降水时间为 152 d，4—6月份降雨量多，10月至翌年2月降雨量少，呈不均匀季节性分配，且垂直变化程度较大。松林内偶有枫香(Liquidambarformosana)、毛竹(Phyllostachysedulis)、青冈栎(Quercusglauca)、板栗(Castaneamollissima)、乌桕(Triadicasebifera)等乔木存在。

1.2 天牛种类调查

野外收集：2017年5月29日在博村林场马尾松林内悬挂110个诱捕器，诱芯为APF-Ⅰ型松墨天牛高效诱剂(厦门三涌生物科技有限公司)，每周收集1次诱捕器内天牛，用塑料瓶将天牛带回室内。室内收集：选择有天牛侵入孔的马尾松疫木放入养虫笼中，待其中天牛羽化后收集天牛。

对收集到的天牛进行整姿、鉴定，并记录种类和数量，使用型号为Discovery 28蔡司体视显微镜(德国卡尔蔡司股份有限公司)对天牛进行拍照。

1.3 线虫媒介天牛种类调查

分离实验使用的松墨天牛、短角幽天牛、赤梗天牛(Arhopalusunicolor)、桃红颈天牛和弧纹虎天牛(Chlorophorusmiwai)用诱捕器获得，小灰长角天牛和齿角坡天牛(Pterolophiaserrata)用养虫笼收集。每周实验选择有活力且可以危害马尾松的天牛装入50 mL离心管带回实验室，每个离心管装1头天牛。在实验室用剪刀将天牛剪碎，使用贝尔曼漏斗法对各种天牛进行单头天牛线虫分离实验，12 h后，用15 mL离心管接取漏斗下端天牛浸泡液，做好标记，将离心管放在离心机中12 000 r/min 离心3 min，用移液枪吸取离心管上部液体至废液缸，保留5 mL天牛浸泡液用于镜检实验，观察天牛浸泡液是否含有线虫以确定天牛是否携带线虫。

1.4 天牛携带线虫种类调查

线虫形态学观察。将保留的5 mL线虫分离液全部倒入直径30 mm的一次性培养皿中，在光学显微镜下使用10倍物镜对培养皿中所有线虫进行观察，依据尾部形态对扩散型线虫进行初步判断，再将不同形态特征的线虫分别挑取100条置于灰葡萄孢和炭疽菌上培养，待线虫取食真菌90%后，使用贝尔曼漏斗法分离线虫，在光学显微镜下，通过观察雌成虫和雄成虫头部、尾部、口针、食道腺以及生殖系统对线虫进行形态学鉴定。

松材线虫分子检测。由于天牛携带线虫为扩散型线虫，其形态特征不明显[23]，为确定天牛是否携带松材线虫，用移液枪吸取线虫液5 μL(含1～3条线虫)于1.5 mL离心管中，加入5 μL线虫DNA提取液A液和1 μL线虫DNA提取液B液(南京生兴有害生物防治技术股份有限公司)，振荡混匀，将离心管放入金属浴(上海一恒科技有限公司)中；95 ℃加热45 min，65 ℃加热10 min；12 000 r/min离心3 min；取上清3.5 μL加入200 μL PCR管中，加入5 μL松材线虫检测试剂K液和1.5 μL松材线虫检测试剂P液(南京生兴有害生物防治技术股份有限公司)，振荡混匀，短暂离心，将PCR管置于Bx-48松材线虫自动化分子检测仪(杭州博日科技有限公司)进行分子检测[24]。

对于松材线虫分子检测技术和形态学均无法确定的线虫，使用线虫28S rDNA引物对基因组DNA进行扩增，其中DNA 提取参考陈凤毛等[25]方法，28S rDNA引物序列以及PCR扩增程序参见宋雅婷等[26]方法。扩增产物在1.0%(质量分数)的琼脂糖凝胶上电泳20 min，并在UVP-GelDoc-It2315成像仪(Ultra-Violet Products Ltd.，美国)观察拍摄。PCR 产物由南京Genscript测序公司直接纯化并双向测序，在GenBank数据库(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)中对获得的序列进行BLAST同源比对分析。运用MEGA软件中的Clustal W 程序进行序列拼接、比对，以邻接(NJ)法构建线虫28S rDNA的系统发育树，选择伞滑刃属(Bursaphelenchus)作为外群。

1.5 天牛携带线虫比率和数量的统计

试验收集到的小灰长角天牛中仅有3头可以携带线虫，且天牛携带线虫的数量均小于5条，因此仅对松墨天牛在不同时间携带线虫的比例和数量进行统计。由于黄山地区5月和6月雨水多，从6月19日—6月25日作为第一个时间段(于6月25日)开始统计天牛携带线虫的比例和数量，以后每周统计1次(即6月25日、7月2日、7月9日、7月16日、7月23日)，直至试验结束，共统计5次松墨天牛携带线虫的比例和数量，其中天牛携带线虫率的计算公式为：携带线虫的雌(雄)成虫数量/用于分离线虫的雌(雄)成虫总数×100%。

1.6 数据处理

天牛携带线虫的比例和数量变化使用Excel 2019进行数据统计，天牛携带线虫的比例和数量变化则使用GraphPad 8.0进行作图。

2 结果与分析

2.1 天牛种类分析

经研究发现，实验共收集到14种天牛(表1)，分属于4个亚科(沟胫天牛亚科、幽天牛亚科、锯天牛亚科和花天牛亚科)、12个属，其中有6种天牛的寄主植物为马尾松，包括松墨天牛、小灰长角天牛、短角幽天牛、赤梗天牛、齿角坡天牛和弧纹虎天牛，在6种天牛中，松墨天牛的数量最多，占所有天牛数量的98%以上；其次为小灰长角天牛、弧纹虎天牛和斑角坡天牛，其余天牛诱捕到的数量较少。

表1 马尾松林诱捕天牛种类

2.2 媒介天牛种类分析

通过对松墨天牛、短角幽天牛、赤梗天牛、桃红颈天牛、弧纹虎天牛、小灰长角天牛和齿角坡天牛的线虫分离液镜检，结果表明在短角幽天牛、赤梗天牛、桃红颈天牛、弧纹虎天牛和齿角坡天牛的线虫分离液中并未发现任何线虫，仅在松墨天牛和小灰长角天牛的线虫分离液中发现一定数量的寄生线虫，其中松墨天牛携带线虫的比例为45.8%，小灰长角天牛携带线虫的比例为13.6%。

通过对天牛体内线虫形态学观察发现，黄山地区松墨天牛和小灰长角天牛可以携带两种扩散型寄生线虫，其中一种扩散型线虫尾形钝尖(下文称为尖尾线虫)(图1A)，另一种扩散型线虫尾形指圆(下文称为圆尾线虫)(图1B)。

通过松材线虫分子检测鉴定尖尾线虫为松材线虫(图2A)，通过真菌培养，其雌成虫和雄成虫的形态特征与松材线虫相同，进一步确定为松材线虫;而圆尾线虫通过炭疽菌培养，观察其繁殖型线虫特征为成虫头部无缢缩，口针基部明显，无中食道球，雌成虫无阴门盖，尾部指圆形，线虫热杀死后略向腹部弯曲，雄成虫交合刺无喙突，尾部尖，热杀死后线虫直伸，雄虫交合伞椭圆形(图3)，其序列比对结果与Contortylenchussp.相似度最高，系统发育树结果进一步显示与Contortylenchussp.聚在一个分支上(图2B)，综合以上结果，初步鉴定天牛携带圆尾线虫为Contortylenchussp.线虫。

2.3 天牛携带线虫数量变化

研究发现，各统计日中6月25日时松墨天牛雌成虫和雄成虫线虫携带率均为76.5%，线虫平均携带量分别为1 018.0条/头和495.1条/头(图4)。7月2日时松墨天牛雌成虫和雄成虫线虫携带率分别为66.0%和60.0%，线虫平均携带量分别为530.1条/头和68.3条/头。7月9日时松墨天牛雌成虫和雄成虫线虫携带率分别为52.9%和50.0%，线虫平均携带量分别为202.5条/头和74.9条/头。7月16日时松墨天牛雌成虫和雄成虫线虫携带率分别为34.7%和30.8%，线虫平均携带量分别为200.4条/头和8.2条/头。7月23日时松墨天牛雌成虫和雄成虫线虫携带率分别为10.0%和14.7%，线虫平均携带量分别为 80.0条/头和3.8条/头。可见，松墨天牛雌成虫线虫携带率和携带量大于松墨天牛雄成虫线虫携带率和携带量，且松墨天牛携带率和携带量随时间的推移而减少。

3 讨 论

已有研究发现，松树体内寄生多种线虫[27-29]，同时也生存多种蛀干害虫。当松树内蛀干害虫的生活史和松树内的线虫生活史同步时，蛀干害虫在羽化时便有可能携带线虫[30]。本实验选择在黄山市博村林场对当地媒介昆虫进行调查，实验共收集到14种天牛，其中危害松树的天牛有6种，松墨天牛的种群数量占绝对优势，其他天牛种群数量远远小于松墨天牛种群数量。这可能与天牛诱捕器的诱芯相关，也可能与林地环境相关。天牛携带线虫种类和比例受到线虫种类和种群大小、天牛种类和种群的大小、疫木含水量以及疫木内微生物种类等多种因素影响[31-35]。在6种危害松树的天牛中，仅松墨天牛和小灰长角天牛携带线虫，且松墨天牛在黄山博村林场6月下旬天牛种群数量大，在7月下旬时天牛数量明显减少。松墨天牛作为亚洲地区松材线虫主要媒介昆虫，一直以来被当作媒介昆虫防治的重点对象。小灰长角天牛作为黄山博村林场马尾松主要蛀干天牛之一[21]，也曾被报道可以携带松材线虫，但是小灰长角天牛携带的线虫数量和比例远小于松墨天牛携带线虫的数量和比例[18]。短角幽天牛曾在日本被报道携带松材线虫[14]，在中国，至今未见短角幽天牛可以携带松材线虫的报道，但有研究发现短角幽天牛可以携带拟松材线虫[22]。桃红颈天牛作为蔷薇科李属植物上一种常见天牛，也曾被报道可以携带上百条松材线虫[36]，但在本实验中均未在短角幽天牛、桃红颈天牛、弧纹虎天牛和齿角坡天牛体内分离到松材线虫，这可能与本次收集到的天牛种群大小相关。

前人研究报道指出松墨天牛可以携带3种寄生线虫，即松材线虫、拟松材线虫(B.mucronatus)和卵巢线虫(Contortylenchusgenitalicola)[37]，本实验收集到的松墨天牛携带的线虫有两种，一种为松材线虫，另外一种为Contortylenchussp.线虫，并未发现拟松材线虫，这可能与当地松树体内寄生线虫种类有关。卵巢线虫是一种在松墨天牛卵巢内发现的一种寄生线虫[38]，也具有扩散型和繁殖型两个阶段。当卵巢线虫处在扩散型阶段，其生活史与腊肠线虫科线虫生活史相似，当其处在繁殖阶段，卵巢线虫生活史与新垫仞线虫科显腺属线虫生活史相似[39]，虽然有学者对卵巢线虫形态进行研究报道，但不同地理种群的线虫会适应环境形态发生变化，因此对天牛通过分子生物学[40]以及形态学鉴定观察最终将天牛携带的圆尾线虫确定为Contortylenchussp.线虫。松墨天牛携带松材线虫的比例和数量受多种因素影响。经统计不同时间松墨天牛携带松材线虫的数量和比例发现马尾松林内松墨天牛携带线虫的比例和数量随时间推移逐渐减少，这与赵锦年等[41]和柴希民等[42]研究结果不同，赵锦年和柴希民等研究发现不同时间羽化的松墨天牛携带线虫具有明显的单峰或者双峰现象，本研究中天牛在6月19日—6月25日期间携带线虫的比例最高，携带线虫量最多，后面逐渐减少这可能是由于黄山地区5月和6月雨水天气多，试验未对该时期内羽化出的松墨天牛携带线虫的比例和数量进行统计的结果。天牛携带线虫数量和比例逐渐减少的原因可能是由于枯死松树内大量线虫在天牛早期羽化借助天牛传播，或者天气持续高温，枯死木内水分含量下降，导致天牛携带线虫的比例和数量逐渐减少。